Alzheimerio ligai (AD) trūksta baltymų biomarkerių, atspindinčių įvairias pagrindines patofiziologijas, trukdančių diagnozuoti ir gydyti. Čia mes naudojame išsamią proteomiką, kad nustatytų smegenų skysčio (CSF) biomarkerius, kurie atspindi platų AD patofiziologijos spektrą. Daugkartinė masės spektrometrija nustatė atitinkamai maždaug 3500 ir maždaug 12 000 baltymų AD CSF ir smegenyse. Smegenų proteomo tinklo analizė išsprendė 44 biologinės įvairovės modulius, iš kurių 15 sutapo su smegenų skysčio proteomu. CSF AD žymenys šiuose persidengiančiuose moduliuose yra sulankstyti į penkias baltymų grupes, atspindinčias skirtingus patofiziologinius procesus. Sinapsės ir metabolitai AD smegenyse mažėja, tačiau CSF didėja, o smegenyse ir CSF didėja glijos turtingos mielinizacijos ir imuninės grupės. Skydelio pokyčių nuoseklumas ir ligos specifiškumas buvo patvirtintas daugiau nei 500 papildomų CSF mėginių. Šios grupės taip pat nustatė asimptominio AD biologinius pogrupius. Apskritai šie rezultatai yra daug žadantis žingsnis link internetinių biologinių žymenų įrankių, skirtų klinikiniam AD taikymui.
Alzheimerio liga (AD) yra dažniausia neurodegeneracinės demencijos priežastis visame pasaulyje ir jai būdingi įvairūs biologinės sistemos sutrikimai, įskaitant sinapsinį perdavimą, glialinį imunitetą ir mitochondrijų metabolizmą (1–3). Tačiau nustatyti baltymų biomarkeriai vis dar sutelkia dėmesį į amiloido ir tau baltymų aptikimą, todėl negali atspindėti šios įvairios patofiziologijos. Šie „pagrindiniai“ baltymų biomarkeriai, kurie patikimiausiai išmatuojami smegenų skystyje (CSF), apima (i) amiloido beta peptidą 1-42 (Aβ1-42), kuris atspindi žievės amiloidinių plokštelių susidarymą; (ii) bendras tau, aksono degeneracijos požymis; (iii) fosfo-tau (p-tau), patologinio tau hiperfosforilinimo atstovas (4-7). Nors šie smegenų skysčio biomarkeriai labai palengvino „žymių“ AD baltymų ligų aptikimą (4–7), jie sudaro tik nedidelę sudėtingos ligos biologijos dalį.
Patofiziologinės AD biomarkerių įvairovės trūkumas sukėlė daug iššūkių, įskaitant (i) nesugebėjimą nustatyti ir kiekybiškai įvertinti AD sergančių pacientų biologinį heterogeniškumą, (ii) nepakankamą ligos sunkumo ir progresavimo matavimą, ypač ikiklinikinėje stadijoje, ir iii) terapinių vaistų, kurių nepavyko visiškai išspręsti visų neurologinio pablogėjimo aspektų, kūrimas. Mūsų pasitikėjimas svarbia patologija apibūdinant AD nuo susijusių ligų tik pablogina šias problemas. Vis daugiau įrodymų rodo, kad daugumai senyvo amžiaus žmonių, sergančių demencija, būdinga daugiau nei viena patologinė kognityvinio susilpnėjimo ypatybė (8). Net 90% ar daugiau asmenų, sergančių AD patologija, taip pat serga kraujagyslių ligomis, TDP-43 inkliuzais ar kitomis degeneracinėmis ligomis (9). Šios didelės patologinio sutapimo proporcijos sutrikdė mūsų dabartinę demencijos diagnostikos sistemą, todėl reikia išsamesnio patofiziologinio ligos apibrėžimo.
Atsižvelgiant į neatidėliotiną įvairių AD biomarkerių poreikį, šioje srityje vis dažniau imamasi „omikos“ metodo, pagrįsto bendra sistema biomarkeriams atrasti. „Accelerated Pharmaceutical Partnership“ (AMP)-AD aljansas buvo pradėtas 2014 m. ir yra programos priešakyje. Šiomis daugiadalykėmis Nacionalinių sveikatos institutų, akademinės bendruomenės ir pramonės pastangomis siekiama naudoti sistemines strategijas, siekiant geriau apibrėžti AD patofiziologiją ir sukurti biologinės įvairovės diagnostikos analizės ir gydymo strategijas (10). Kaip šio projekto dalis, tinklo proteomika tapo perspektyvia priemone tobulinant sisteminius biomarkerius AD. Šis nešališkas duomenimis pagrįstas metodas organizuoja sudėtingus proteomikos duomenų rinkinius į bendrai išreikštų baltymų grupes arba „modulius“, susijusius su specifiniais ląstelių tipais, organeliais ir biologinėmis funkcijomis (11–13). Buvo atlikta beveik 12 informacijos turtingų tinklo proteomikos tyrimų su AD smegenimis (13–23). Apskritai šios analizės rodo, kad AD smegenų tinklo proteomas palaiko labai konservuotą modulinę organizaciją nepriklausomose grupėse ir keliuose žievės regionuose. Be to, kai kurie iš šių modulių rodo atkuriamus su AD susijusio gausos pokyčius duomenų rinkiniuose, atspindinčius daugelio ligų patofiziologiją. Visi šie atradimai rodo daug žadantį pagrindą smegenų tinklo proteomui, kaip sisteminiam AD biomarkeriui, atrasti.
Siekdami paversti AD smegenų tinklo proteomą kliniškai naudingais sisteminiais biomarkeriais, iš smegenų gautą tinklą sujungėme su AD CSF proteomine analize. Šis integruotas požiūris leido nustatyti penkis perspektyvius CSF biomarkerių rinkinius, susijusius su įvairia smegenų patofiziologija, įskaitant sinapses, kraujagysles, mielinizaciją, uždegimą ir medžiagų apykaitos takų disfunkciją. Mes sėkmingai patvirtinome šias biomarkerių plokštes atlikdami daugybę replikacijos analizių, įskaitant daugiau nei 500 CSF mėginių iš įvairių neurodegeneracinių ligų. Šios patvirtinimo analizės apima pacientų, sergančių besimptome AD (AsymAD), CSF grupių taikinių tyrimą arba nenormalaus amiloido kaupimosi įprastoje kognityvinėje aplinkoje įrodymus. Šios analizės išryškina reikšmingą biologinį AsymAD populiacijos nevienalytiškumą ir nustato skydelio žymenis, kurie gali suskirstyti asmenis ankstyviausiose ligos stadijose. Apskritai šie rezultatai yra pagrindinis žingsnis kuriant baltymų biomarkerių priemones, pagrįstas keliomis sistemomis, kurios gali sėkmingai išspręsti daugelį klinikinių iššūkių, su kuriais susiduria AD.
Pagrindinis šio tyrimo tikslas – nustatyti naujus smegenų skysčio biomarkerius, atspindinčius įvairią smegenų patofiziologiją, sukeliančią AD. S1 paveiksle aprašyta mūsų tyrimo metodika, kuri apima (i) išsamią analizę, pagrįstą preliminariais AD CSF ir tinklo smegenų proteomo išvadomis, siekiant nustatyti kelis su smegenimis susijusius CSF ligų biomarkerius, ir (ii) vėlesnę replikaciją Šie biomarkeriai yra keliose nepriklausomose smegenų stuburo sistemose. skystos kohortos. Į atradimus orientuotas tyrimas prasidėjo nuo skirtingos CSF raiškos analizės 20 kognityviai normalių asmenų ir 20 AD pacientų Emory Goizueta Alzheimerio ligos tyrimų centre (ADRC). AD diagnozė apibrėžiama kaip reikšmingas pažinimo sutrikimas, kai smegenų skystyje yra mažas Aβ1-42 ir padidėjęs bendrojo tau ir p-tau kiekis [Monrealio pažinimo vertinimo vidurkis (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (S1A lentelė). Kontrolės (vidurkis MoCA, 26,7 ± 2,2) CSF biomarkerių lygis buvo normalus.
Žmogaus CSF būdingas dinaminis baltymų gausos diapazonas, kuriame albuminas ir kiti ypač gausūs baltymai gali užkirsti kelią dominančių baltymų aptikimui (24). Norėdami padidinti baltymų atradimo gylį, prieš masių spektrometrijos (MS) analizę pašalinome pirmuosius 14 labai gausių baltymų iš kiekvieno CSF mėginio (24). Iš viso MS nustatė 39 805 peptidus, kurie buvo susieti su 3691 proteoma 40 mėginių. Baltymų kiekybinis nustatymas atliekamas naudojant kelių tandeminių masės žymenų (TMT) žymėjimą (18, 25). Norėdami išspręsti trūkstamus duomenis, į tolesnę analizę įtraukėme tik tuos baltymus, kurie buvo kiekybiškai įvertinti bent 50% mėginių, taigi galiausiai kiekybiškai įvertinome 2875 proteomas. Dėl reikšmingo bendro baltymų kiekio skirtumo kontrolinis mėginys statistiškai buvo laikomas išskirtiniu (13) ir nebuvo įtrauktas į tolesnę analizę. Likusių 39 mėginių gausos vertės buvo pakoreguotos pagal amžių, lytį ir partijos kovariaciją (13-15, 17, 18, 20, 26).
Naudojant statistinę t-testo analizę diferencinei išraiškai regresijos duomenų rinkinyje įvertinti, ši analizė nustatė baltymus, kurių gausos lygiai reikšmingai pasikeitė (P <0,05) tarp kontrolinio ir AD atvejų (S2A lentelė). Kaip parodyta 1A paveiksle, iš viso 225 baltymų gausa sergant AD buvo žymiai sumažinta, o 303 baltymų gausa žymiai padidėjo. Šie skirtingai išreikšti baltymai apima keletą anksčiau nustatytų smegenų skysčio AD žymenų, tokių kaip su mikrotubuliais susijęs baltymas tau (MAPT; P = 3,52 × 10–8), neurofilamentas (NEFL; P = 6,56 × 10–3), su augimu susijęs baltymas 43 (GAP43; P = 1,46 × 10-5), riebiąsias rūgštis surišantis baltymas 3 (FABP3; P = 2,00 × 10-5), chitinazė 3 panašus į 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10-6), nervų granulės (NRGN; P = 3,43 × 10-4) ir VGF nervų augimo faktorius (VGF; P = 4,83 × 10-3) (4-6). Tačiau mes taip pat nustatėme kitus labai svarbius taikinius, tokius kaip BVP disociacijos inhibitorius 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) ir su SPARC susijęs modulinis kalcio surišimas 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). 225 žymiai sumažintų baltymų genų ontologijos (GO) analizė atskleidė glaudžius ryšius su kūno skysčių procesais, tokiais kaip steroidų metabolizmas, kraujo krešėjimas ir hormonų aktyvumas (1B pav. ir S2B lentelė). Priešingai, žymiai padidėjęs 303 baltymas yra glaudžiai susijęs su ląstelių struktūra ir energijos metabolizmu.
(A) Vulkano diagrama rodo log2 kartotinį pokytį (x ašis), palyginti su -log10 statistine P verte (y ašimi), gauta atliekant t testą, kuris naudojamas aptikti skirtingą išraišką tarp kontrolinio (CT) ir Visų baltymų CSF proteomo AD atvejai. Baltymai, kurių lygis yra žymiai sumažintas (P <0, 05), sergant AD, rodomi mėlynai, o baltymai, kurių ligos lygis žymiai padidėjo, rodomi raudonai. Pasirinktas baltymas yra paženklintas. (B) Pagrindiniai GO terminai, susiję su baltymais, AD yra žymiai sumažinti (mėlyna) ir padidėjusi (raudona). Rodomi trys GO terminai, turintys aukščiausius z balus biologinių procesų, molekulinių funkcijų ir ląstelių komponentų srityse. (C) MS išmatavo MAPT lygį CSF mėginyje (kairėje) ir jo koreliaciją su mėginio ELISA tau lygiu (dešinėje). Rodomas Pearsono koreliacijos koeficientas su atitinkama P reikšme. Kadangi trūksta ELISA duomenų vienam AD atvejui, šie skaičiai apima 38 iš 39 analizuotų atvejų vertes. (D) Prižiūrėta klasterių analizė (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) pakoreguota P <0,01) kontrolinėje ir AD CSF rasta mėginiuose, naudojant 65 labiausiai pakitusius baltymus duomenų rinkinyje. Standartizuoti, normalizuoti.
MAPT proteominis lygis yra glaudžiai susijęs su nepriklausomai išmatuotu ELISA tau lygiu (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; 1C paveikslas), patvirtinantis mūsų MS matavimo pagrįstumą. Suskaidžius tripsiną amiloido pirmtako baltymo (APP) lygiu, izoformai specifiniai peptidai, susieti su Aβ1-40 ir Aβ1-42 C-galu, negali būti efektyviai jonizuojami (27, 28). Todėl mūsų nustatyti APP peptidai neturi nieko bendra su ELISA Aβ1-42 lygiais. Siekdami įvertinti kiekvieno atvejo skirtingą raišką, mes panaudojome skirtingai išreikštus baltymus, kurių P <0,0001 [klaidingo atradimo dažnis (FDR), pataisytas P <0,01], kad atliktume prižiūrimą mėginių klasterinę analizę (S2A lentelė). Kaip parodyta 1D paveiksle, šie 65 labai reikšmingi baltymai gali teisingai sugrupuoti mėginius pagal ligos būklę, išskyrus vieną AD atvejį, turintį panašias į kontrolę savybes. Iš šių 65 baltymų 63 padidėjo sergant AD, o tik dviejų (CD74 ir ISLR) sumažėjo. Iš viso šios cerebrospinalinio skysčio analizės nustatė šimtus AD baltymų, kurie gali būti ligos biomarkeriai.
Tada atlikome nepriklausomą AD smegenų proteomo tinklo analizę. Šio atradimo smegenų grupė apėmė dorsolaterinę prefrontalinę žievę (DLPFC) iš kontrolinės (n = 10), Parkinsono ligos (PD; n = 10), mišrios AD / PD (n = 10) ir AD (n = 10) atvejų. ) Pavyzdys. Emery Goizueta ADRC. Šių 40 atvejų demografiniai rodikliai buvo aprašyti anksčiau (25) ir apibendrinti S1B lentelėje. Mes panaudojome TMT-MS, kad ištirtume šiuos 40 smegenų audinių ir 27 atvejų replikacijos grupę. Iš viso šie du smegenų duomenų rinkiniai sukūrė 227 121 unikalų peptidą, kuris buvo susietas su 12 943 proteomais (25). Į vėlesnius tyrimus buvo įtraukti tik tie baltymai, kurie buvo kiekybiškai įvertinti bent 50% atvejų. Galutiniame atradimo duomenų rinkinyje yra 8817 kiekybiškai įvertintų baltymų. Koreguokite baltymų gausos lygį pagal amžių, lytį ir pomirtinį intervalą (PMI). Duomenų rinkinio diferencinės ekspresijos analizė po regresijos parodė, kad daugiau nei 2000 baltymų lygiai buvo reikšmingai pakisti [P <0,05, dispersijos analizė (ANOVA)] dviejose ar daugiau ligų grupių. Tada atlikome prižiūrimą klasterių analizę, pagrįstą skirtingai išreikštais baltymais ir P <0, 0001 AD / kontrolinėje ir (arba) AD / PD palyginime (S2, A ir B paveikslai, S2C lentelė). Šie 165 labai pakeisti baltymai aiškiai vaizduoja AD patologijos atvejus iš kontrolinių ir PD mėginių, patvirtinančių stiprius AD specifinius pokyčius visame proteome.
Tada mes panaudojome algoritmą, vadinamą Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA), kad atliktume atrasto smegenų proteomo tinklo analizę, kuri suskirsto duomenų rinkinį į baltymų modulius su panašiais ekspresijos modeliais (11–13). Analizė nustatė 44 modulius (M) kartu ekspresuojančius baltymus, surūšiuotus ir sunumeruotus nuo didžiausių (M1, n = 1821 baltymas) iki mažiausio (M44, n = 34 baltymai) (2A paveikslas ir S2D lentelė)). Kaip minėta pirmiau (13) Apskaičiuokite reprezentatyvų kiekvieno modulio ekspresijos profilį arba būdingą baltymą ir susiekite jį su ligos būkle ir AD patologija, ty nustatykite Alzheimerio ligos registro (CERAD) ir Braak balo sąjungą (2B pav.). Iš viso 17 modulių buvo reikšmingai susiję su AD neuropatologija (p <0,05). Daugelyje šių su liga susijusių modulių taip pat gausu ląstelių tipui būdingų žymenų (2B pav.). Kaip minėta pirmiau (13), ląstelių tipo sodrinimas nustatomas analizuojant modulio sutapimą ir ląstelių tipui būdingų genų etaloninį sąrašą. Šie genai yra gauti iš paskelbtų duomenų apie izoliuotus pelių neuronus, endotelio ir glijos ląsteles. RNR sekos nustatymo (RNA-seq) eksperimentas (29).
(A) Atraskite smegenų proteomo WGCNA. (B) Modulinio parašo baltymo (pirmojo pagrindinio modulinio baltymo ekspresijos komponento) dvisvorio koreliacijos (BiCor) analizė su AD neuropatologinėmis savybėmis (viršuje), įskaitant CERAD (Aβ plokštelės) ir Braak (tau raizgynes) balus. Teigiamos (raudonos) ir neigiamos (mėlynos) koreliacijos intensyvumas rodomas dviejų spalvų šilumos žemėlapiu, o žvaigždutės nurodo statistinį reikšmingumą (P <0,05). Naudokite hipergeometrinį Fišerio tikslų testą (FET) (apačioje), kad įvertintumėte kiekvieno baltymo modulio ląstelių tipo ryšį. Raudono atspalvio intensyvumas rodo ląstelių tipo sodrinimo laipsnį, o žvaigždutė – statistinį reikšmingumą (P <0,05). Naudokite BH metodą, kad ištaisytumėte P reikšmę, gautą iš FET. (C) modulinių baltymų GO analizė. Labiausiai susiję biologiniai procesai rodomi kiekvienam moduliui arba susijusiai modulių grupei. oligo, oligodendrocitas.
Penkių glaudžiai susijusių astrocitų ir mikroglijų turinčių modulių rinkinys (M30, M29, M18, M24 ir M5) parodė stiprią teigiamą koreliaciją su AD neuropatologija (2B pav.). Ontologijos analizė susieja šiuos glialinius modulius su ląstelių augimu, proliferacija ir imunitetu (2C pav. ir S2E lentelė). Du papildomi glijos moduliai, M8 ir M22, taip pat yra stipriai reguliuojami sergant ligomis. M8 yra labai susijęs su Toll tipo receptorių keliu, signalizacijos kaskada, kuri atlieka pagrindinį vaidmenį įgimtame imuniniame atsake (30). Tuo pačiu metu M22 yra glaudžiai susijęs su potransliaciniu modifikavimu. M2, kuriame gausu oligodendrocitų, rodo stiprią teigiamą koreliaciją su AD patologija ir ontologinį ryšį su nukleozidų sinteze ir DNR replikacija, o tai rodo padidėjusį ląstelių proliferaciją sergant ligomis. Apskritai, šios išvados patvirtina glialinių modulių padidėjimą, kurį anksčiau stebėjome AD tinklo proteome (13, 17). Šiuo metu nustatyta, kad daugelis su AD susijusių glialinių modulių tinkle rodo žemesnį ekspresijos lygį kontroliniais ir PD atvejais, pabrėžiant jų ligos specifiškumą, kuris yra padidėjęs AD (S2C pav.).
Tik keturi mūsų tinklo proteomo moduliai (M1, M3, M10 ir M32) stipriai neigiamai koreliuoja su AD patologija (P <0,05) (2 pav., B ir C). Tiek M1, tiek M3 yra daug neuronų žymenų. M1 yra labai susijęs su sinapsiniais signalais, o M3 yra glaudžiai susijęs su mitochondrijų funkcija. Nėra įrodymų apie M10 ir M32 ląstelių tipo praturtėjimą. M32 atspindi ryšį tarp M3 ir ląstelių metabolizmo, o M10 yra labai susijęs su ląstelių augimu ir mikrotubulų funkcija. Palyginti su AD, visų keturių modulių kontrolė ir PD yra padidintos, todėl jiems būdingi ligai būdingi AD pokyčiai (S2C pav.). Apskritai šie rezultatai patvirtina sumažėjusį neuronų turinčių modulių gausą, kurią anksčiau stebėjome sergant AD (13, 17). Apibendrinant galima pasakyti, kad smegenų proteomo tinklo analizė, kurią atradome, sukūrė AD specifiškai pakeistus modulius, atitinkančius mūsų ankstesnius rezultatus.
AD būdinga ankstyva besimptomė stadija (AsymAD), kai asmenims pasireiškia amiloido kaupimasis be klinikinio pažinimo nuosmukio (5, 31). Šis asimptominis etapas yra kritinis ankstyvo aptikimo ir įsikišimo langas. Anksčiau mes įrodėme stiprų modulinį AsymAD ir AD smegenų tinklo proteomo išsaugojimą nepriklausomuose duomenų rinkiniuose (13, 17). Siekdami užtikrinti, kad šiuo metu atrastas smegenų tinklas atitiktų šias ankstesnes išvadas, išanalizavome 44 modulių išsaugojimą pakartotame duomenų rinkinyje iš 27 DLPFC organizacijų. Šios organizacijos apima kontrolės (n = 10), AsymAD (n = 8) ir AD (n = 9) atvejus. Kontroliniai ir AD mėginiai buvo įtraukti į mūsų atradimų smegenų kohortos analizę (S1B lentelė), o AsymAD atvejai buvo unikalūs tik replikacijos grupėje. Šie AsymAD atvejai taip pat atkeliavo iš Emory Goizueta ADRC smegenų banko. Nors pažinimas mirties metu buvo normalus, amiloido lygis buvo neįprastai aukštas (vidutinis CERAD, 2,8 ± 0,5) (S1B lentelė).
Šių 27 smegenų audinių TMT-MS analizė leido kiekybiškai įvertinti 11 244 proteomas. Šis galutinis skaičius apima tik tuos baltymus, kurių kiekis yra bent 50% mėginių. Šiame pakartotų duomenų rinkinyje yra 8638 (98,0 %) iš 8817 baltymų, aptiktų atliekant mūsų atradimo smegenų analizę, ir beveik 3000 reikšmingų baltymų pakitimų tarp kontrolinės ir AD kohortų (P <0,05, atlikus Tukey suporuotą t testą dispersijos analizei) ( S2F lentelė). Tarp šių skirtingai išreikštų baltymų 910 taip pat parodė reikšmingus lygio pokyčius tarp AD ir smegenų proteomų kontrolės atvejų (P <0, 05, po ANOVA Tukey suporuoto t testo). Verta paminėti, kad šie 910 žymenys yra labai nuoseklūs proteomų kaitos kryptimi (r = 0, 94, P <1, 0 × 10-200) (S3A pav.). Tarp padidėjusių baltymų baltymai, turintys nuosekliausius pokyčius tarp duomenų rinkinių, daugiausia yra M5 ir M18 modulių (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 ir GFAP) nariai. Tarp sumažėjusių baltymų tie, kurių pokyčiai buvo nuosekliausi, buvo beveik išimtinai M1 modulio nariai (NPTX2, VGF ir RPH3A), susiję su sinapse. Toliau patikrinome su AD susijusius midkine (MDK), CD44, išskiriamo su garbanomis susijusio baltymo 1 (SFRP1) ir VGF pokyčius Western blot metodu (S3B pav.). Modulio išsaugojimo analizė parodė, kad maždaug 80% baltymų modulių (34/44) smegenų proteomuose buvo žymiai išsaugoti replikacijos duomenų rinkinyje (z-score> 1,96, FDR pataisytas P <0,05) (S3C pav.). Keturiolika šių modulių buvo specialiai rezervuoti tarp dviejų proteomų (z-score> 10, FDR pataisyta P <1,0 × 10-23). Apskritai, didelio diferencinės ekspresijos ir modulinės sudėties tarp smegenų proteomų nuoseklumo atradimas ir replikacija pabrėžia AD priekinės žievės baltymų pokyčių atkuriamumą. Be to, tai taip pat patvirtino, kad AsymAD ir labiau pažengusios ligos turi labai panašią smegenų tinklo struktūrą.
Išsamesnė diferencinės ekspresijos analizė smegenų replikacijos duomenų rinkinyje parodo reikšmingą AsymAD baltymų pokyčių laipsnį, įskaitant iš viso 151 reikšmingai pakitusį baltymą tarp AsymAD ir kontrolinio (P <0, 05) (S3D pav.). Atsižvelgiant į amiloido apkrovą, APP AsymAD ir AD smegenyse žymiai padidėjo. MAPT labai pasikeičia tik sergant AD, o tai atitinka padidėjusį susipainiojimo lygį ir žinomą jo ryšį su pažinimo nuosmukiu (5, 7). Moduliai, kuriuose gausu glijos (M5 ir M18), labai atsispindi padidėjusiuose AsymAD baltymų kiekiuose, o su neuronais susijęs M1 modulis labiausiai reprezentuoja sumažėjusius AsymAD baltymus. Daugelis šių AsymAD žymenų rodo didesnius simptominių ligų pokyčius. Tarp šių žymenų yra SMOC1, glijos baltymas, priklausantis M18, kuris yra susijęs su smegenų augliais ir akių bei galūnių vystymusi (32). MDK yra hepariną surišantis augimo faktorius, susijęs su ląstelių augimu ir angiogeneze (33), kitas M18 narys. Palyginti su kontroline grupe, AsymAD žymiai padidėjo, o po to labiau padidėjo AD. Priešingai, sinapsinis baltymas neuropentraksinas 2 (NPTX2) buvo žymiai sumažintas AsymAD smegenyse. NPTX2 anksčiau buvo siejamas su neurodegeneracija ir turi pripažintą vaidmenį tarpininkaujant sužadinimo sinapsėms (34). Apskritai šie rezultatai atskleidžia įvairius ikiklinikinius AD baltymų pokyčius, kurie, atrodo, progresuoja atsižvelgiant į ligos sunkumą.
Atsižvelgiant į tai, kad atradę smegenų proteomą pasiekėme didelį baltymų aprėpties gylį, stengiamės geriau suprasti jo sutapimą su tinklo lygio AD transkriptu. Todėl mes palyginome atrastą smegenų proteomą su moduliu, kurį anksčiau sukūrėme iš 18 204 AD (n = 308) ir kontrolinių (n = 157) DLPFC audinių (13) genų mikromatricos matavimo. sutampa. Iš viso mes nustatėme 20 skirtingų RNR modulių, iš kurių daugelis parodė specifinių ląstelių tipų, įskaitant neuronus, oligodendrocitus, astrocitus ir mikrogliją, praturtėjimą (3A pav.). Daugybiniai šių modulių AD pakeitimai parodyti 3B paveiksle. Remiantis ankstesne baltymų ir RNR persidengimo analize, naudojant gilesnį nepažymėtą MS proteomą (apie 3000 baltymų) (13), dauguma 44 smegenų proteomų tinklo modulių, kuriuos radome, yra transkripto tinkle. Nėra reikšmingo sutapimo. mūsų atradimas ir atkartojimas 34 baltymų modulių, kurie labai išlaikomi smegenų proteome, tik 14 (~ 40%) išlaikė Fišerio tikslų testą (FET), kuris statistiškai reikšmingai sutampa su transkriptu (3A pav.). Suderinamas su DNR pažeidimo taisymu (P-M25 ir P-M19), baltymų transliacija (P-M7 ir P-M20), RNR surišimu / sujungimu (P-M16 ir P-M21) ir nukreipimu į baltymus (P-M13 ir P- M23) nesutampa su transkripto moduliais. Todėl, nors dabartinėje sutapimo analizėje naudojamas gilesnis proteomų duomenų rinkinys (13), didžioji dalis AD tinklo proteomų nėra susieta su transkripto tinklu.
(A) Hipergeometrinis FET parodo ląstelių tipui būdingų žymenų praturtėjimą AD transkripto RNR modulyje (viršuje) ir AD smegenų RNR (x ašies) ir baltymų (y ašies) modulių sutapimo laipsnį. (apačioje). Raudono atspalvio intensyvumas rodo ląstelių tipų sodrinimo laipsnį viršutiniame skydelyje ir modulių persidengimo intensyvumą apatiniame skydelyje. Žvaigždutės rodo statistinį reikšmingumą (P <0,05). (B) Koreliacijos tarp kiekvieno transkripto modulio būdingų genų ir AD būsenos laipsnis. Kairėje esantys moduliai labiausiai neigiamai koreliuoja su AD (mėlyna), o dešinėje - su AD (raudona). Logiškai transformuota BH pakoreguota P reikšmė rodo kiekvienos koreliacijos statistinio reikšmingumo laipsnį. (C) Reikšmingi persidengiantys moduliai su bendru ląstelių tipo praturtinimu. (D) Pažymėto baltymo (x ašis) ir RNR (y ašis) log2 karto pokyčio koreliacinė analizė persidengiančiame modulyje. Rodomas Pearsono koreliacijos koeficientas su atitinkama P reikšme. Mikro, mikroglia; dangaus kūnai, astrocitai. KT, kontrolė.
Dauguma persidengiančių baltymų ir RNR modulių turi panašius ląstelių tipo sodrinimo profilius ir nuoseklias AD keitimo kryptis (3 pav., B ir C). Kitaip tariant, su sinapse susijęs smegenų proteomo M1 modulis (PM1) yra susietas su trimis daug neuronų turinčiais homologiniais RNR moduliais (R-M1, R-M9 ir R-M16), kurie yra AD. sumažintas lygis. Panašiai glijos turtingi M5 ir M18 baltymų moduliai sutampa su RNR moduliais, kuriuose gausu astrocitų ir mikroglijų žymenų (R-M3, R-M7 ir R-M10), ir yra labai susiję su ligomis. Šios bendros modulinės funkcijos tarp dviejų duomenų rinkinių toliau palaiko ląstelių tipo praturtėjimą ir su liga susijusius pokyčius, kuriuos pastebėjome smegenų proteome. Tačiau šiuose bendruose moduliuose pastebėjome daug reikšmingų skirtumų tarp atskirų žymenų RNR ir baltymų lygių. Šių persidengiančių modulių molekulių proteomikos ir transkriptomikos diferencinės išraiškos koreliacinė analizė (3D pav.) pabrėžia šį nenuoseklumą. Pavyzdžiui, APP ir keli kiti glijos modulio baltymai (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 ir SFRP1) parodė reikšmingą AD proteomo padidėjimą, tačiau AD transkripto pokyčių beveik nebuvo. Šie baltymams būdingi pokyčiai gali būti glaudžiai susiję su amiloidinėmis plokštelėmis (23, 35), išryškindami proteomą kaip patologinių pokyčių šaltinį, ir šie pokyčiai gali neatsispindėti transkripte.
Nepriklausomai išanalizavę mūsų atrastas smegenis ir CSF proteomas, atlikome išsamią dviejų duomenų rinkinių analizę, kad nustatytų AD CSF biomarkerius, susijusius su smegenų tinklo patofiziologija. Pirmiausia turime apibrėžti dviejų proteomų sutapimą. Nors plačiai pripažįstama, kad CSF atspindi neurocheminius AD smegenų pokyčius (4), tikslus AD smegenų ir CSF proteomo sutapimo laipsnis yra neaiškus. Palyginus bendrų genų produktų, aptiktų mūsų dviejuose proteomuose, skaičių, nustatėme, kad beveik 70% (n = 1936) smegenų skystyje nustatytų baltymų taip pat buvo kiekybiškai įvertinti smegenyse (4A pav.). Dauguma šių persidengiančių baltymų (n = 1721) yra susieti su vienu iš 44 bendros ekspresijos modulių iš atradimo smegenų duomenų rinkinio (4B pav.). Kaip ir tikėtasi, šeši didžiausi smegenų moduliai (M1–M6) rodė didžiausią CSF sutapimą. Tačiau yra mažesnių smegenų modulių (pavyzdžiui, M15 ir M29), kurie pasiekia netikėtai didelį persidengimo laipsnį, didesnį nei dvigubai didesnis smegenų modulis. Tai skatina mus priimti išsamesnį, statistiškai pagrįstą metodą smegenų ir smegenų skysčio sutapimui apskaičiuoti.
(A ir B) Atradimo smegenų ir CSF duomenų rinkiniuose aptikti baltymai sutampa. Dauguma šių persidengiančių baltymų yra susiję su vienu iš 44 smegenų bendros ekspresijos tinklo bendros ekspresijos modulių. (C) Atraskite smegenų skysčio proteomo ir smegenų tinklo proteomo sutapimą. Kiekviena šilumos žemėlapio eilutė rodo atskirą hipergeometrinio FET sutapimo analizę. Viršutinėje eilutėje pavaizduotas smegenų modulio ir viso CSF proteomo sutapimas (pilkas / juodas atspalvis). Antroje eilutėje pavaizduota, kad smegenų modulių ir CSF baltymo (nuspalvinto raudonai) sutapimas yra žymiai padidintas AD (P <0, 05). Trečioji eilutė rodo, kad smegenų modulių ir CSF baltymo sutapimas (mėlynas atspalvis) yra žymiai sumažintas sergant AD (P <0, 05). Naudokite BH metodą, kad ištaisytumėte P reikšmę, gautą iš FET. (D) Sulankstomas modulis, pagrįstas ląstelių tipo asociacija ir susijusiais GO terminais. Šiose plokštėse iš viso yra 271 su smegenimis susijęs baltymas, turintis reikšmingą skirtingą ekspresiją CSF proteome.
Naudodami vienpusius FET, įvertinome baltymų persidengimo tarp CSF proteomo ir atskirų smegenų modulių svarbą. Analizė atskleidė, kad iš viso 14 smegenų modulių CSF duomenų rinkinyje turi statistiškai reikšmingų sutapimų (FDR pakoreguotas P <0,05) ir papildomą modulį (M18), kurio sutapimas yra artimas reikšmingumui (FDR pakoreguotas P = 0,06) (4C pav. , viršutinė eilutė). Mus taip pat domina moduliai, kurie stipriai sutampa su skirtingai išreikštais CSF baltymais. Todėl taikėme dvi papildomas FET analizes, kad nustatytų, kuris iš (i) CSF baltymo reikšmingai padidėjo sergant AD ir (ii) CSF baltymas reikšmingai sumažėjo sergant AD (P <0,05, suporuotas t testas AD / kontrolė). Smegenų moduliai reikšmingai sutampa. tarp jų. Kaip parodyta 4C paveikslo vidurinėje ir apatinėje eilutėse, šios papildomos analizės rodo, kad 8 iš 44 smegenų modulių reikšmingai sutampa su baltymu, pridėtu AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 ir M38). . ), tuo tarpu tik du moduliai (M6 ir M15) reikšmingai sutampa su sumažintu baltymu AD CSF. Kaip ir tikėtasi, visi 10 modulių yra 15 modulių, kurie labiausiai sutampa su CSF proteomu. Todėl manome, kad šie 15 modulių yra didelio našumo AD smegenų kilmės CSF biomarkerių šaltiniai.
Šiuos 15 persidengiančių modulių sulankstėme į penkias dideles baltymų plokštes, atsižvelgdami į jų artumą WGCNA medžio diagramoje ir jų ryšį su ląstelių tipais ir genų ontologija (4D pav.). Pirmajame skydelyje yra modulių, kuriuose gausu neuronų žymenų ir su sinapsėmis susijusių baltymų (M1 ir M12). Sinapsinėje skydelyje iš viso yra 94 baltymai, o CSF proteomo lygis labai pasikeitė, todėl jis yra didžiausias su smegenimis susijusių CSF žymenų šaltinis tarp penkių skydelių. Antroji grupė (M6 ir M15) pademonstravo glaudų ryšį su endotelio ląstelių žymenimis ir kraujagyslių kūnu, tokiais kaip „žaizdos gijimas“ (M6) ir „humoralinio imuninio atsako reguliavimas“ (M15). M15 taip pat yra labai susijęs su lipoproteinų metabolizmu, kuris yra glaudžiai susijęs su endoteliu (36). Kraujagyslių skydelyje yra 34 CSF žymenys, susiję su smegenimis. Trečioji grupė apima modulius (M2 ir M4), kurie yra reikšmingai susiję su oligodendrocitų žymenimis ir ląstelių proliferacija. Pavyzdžiui, M2 aukščiausio lygio ontologijos terminai apima „teigiamas DNR replikacijos reguliavimas“ ir „purino biosintezės procesas“. Tuo tarpu M4 apima „glialinių ląstelių diferenciaciją“ ir „chromosomų segregaciją“. Mielinizacijos skydelyje yra 49 CSF žymenys, susiję su smegenimis.
Ketvirtoje grupėje yra daugiausia modulių (M30, M29, M18, M24 ir M5), o beveik visuose moduliuose yra daug mikroglijų ir astrocitų žymenų. Panašiai kaip mielinizacijos skydelyje, ketvirtajame skydelyje taip pat yra modulių (M30, M29 ir M18), kurie yra glaudžiai susiję su ląstelių proliferacija. Kiti šios grupės moduliai yra labai susiję su imunologiniais terminais, tokiais kaip „imuninio poveikio procesas“ (M5) ir „imuninio atsako reguliavimas“ (M24). Glijinėje imuninėje grupėje yra 42 CSF žymenys, susiję su smegenimis. Galiausiai, paskutiniame skydelyje yra 52 su smegenimis susiję žymekliai keturiuose moduliuose (M44, M3, M33 ir M38), kurie visi yra ant kūno, susiję su energijos kaupimu ir metabolizmu. Didžiausias iš šių modulių (M3) yra glaudžiai susijęs su mitochondrijomis ir turi daug neuronams būdingų žymenų. M38 yra vienas iš mažesnių šio metabolomo modulio narių, taip pat pasižymi nedideliu neuronų specifiškumu.
Apskritai šios penkios plokštės atspindi platų AD žievės ląstelių tipų ir funkcijų spektrą ir kartu turi 271 su smegenimis susijusį CSF žymeklį (S2G lentelė). Siekdami įvertinti šių MS rezultatų pagrįstumą, naudojome artumo išplėtimo tyrimą (PEA), ortogoninių antikūnų pagrindu sukurtą technologiją, pasižyminčią tankinimo galimybėmis, dideliu jautrumu ir specifiškumu, ir iš naujo išanalizavome smegenų skysčio mėginius, kuriuos radome šių 271 biomarkerio pogrupį. (n = 36). Šie 36 tikslai parodo PEA AD kartotinio pokytį, kuris yra glaudžiai susijęs su mūsų MS duomenimis (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), o tai tvirtai patvirtino mūsų išsamios MS analizės rezultatus (S4 pav. ).
Biologinės temos, kurias akcentavo mūsų penkios grupės, nuo sinapsinių signalų perdavimo iki energijos apykaitos, yra susijusios su AD patogeneze (1–3). Todėl visi 15 modulių, kuriuose yra šios plokštės, yra susiję su AD patologija smegenų proteome, kurią mes atradome (2B pav.). Labiausiai pastebima yra didelė teigiama patologinė koreliacija tarp mūsų glijos modulių ir stipri neigiama patologinė koreliacija tarp mūsų didžiausių neuronų modulių (M1 ir M3). Mūsų pakartoto smegenų proteomo diferencinės ekspresijos analizė (S3D pav.) taip pat pabrėžia M5 ir M18 gautus glialinius baltymus. Sergant AsymAD ir simptominiu AD, labiausiai padaugėja glijos baltymų ir su M1 susijusių sinapsių. Baltymų sumažėja labiausiai. Šie stebėjimai rodo, kad 271 smegenų skysčio žymeklis, kurį nustatėme penkiose grupėse, yra susiję su ligos procesais AD žievėje, įskaitant tuos, kurie atsiranda ankstyvose besimptomėse stadijose.
Siekdami geriau išanalizuoti skydelio baltymų kitimo kryptį smegenyse ir stuburo skystyje, kiekvienam iš 15 persidengiančių modulių nubrėžėme taip: (i) radome modulio gausos lygį smegenų duomenų rinkinyje ir (ii) modulį. baltymas Skirtumas išreiškiamas smegenų skystyje (S5 pav.). Kaip minėta anksčiau, WGCNA naudojama modulio gausumui arba būdingai baltymų vertei smegenyse nustatyti (13). Vulkano žemėlapis naudojamas apibūdinti skirtingą modulinių baltymų ekspresiją smegenų skystyje (AD / kontrolė). Šie skaičiai rodo, kad trys iš penkių skydelių rodo skirtingas smegenų ir stuburo skysčio išraiškos tendencijas. Du sinapsės skydelio moduliai (M1 ir M12) rodo AD smegenų gausumo lygio sumažėjimą, tačiau žymiai sutampa su padidėjusiu AD CSF baltymu (S5A pav.). Su neuronais susiję moduliai, kuriuose yra metabolomas (M3 ir M38), parodė panašius smegenų ir smegenų skysčio ekspresijos modelius, nenuoseklius (S5E pav.). Kraujagyslių skydelis taip pat parodė skirtingas ekspresijos tendencijas, nors jo moduliai (M6 ir M15) buvo vidutiniškai padidėję AD smegenyse ir sumažėjo sergančiame CSF (S5B pav.). Likusiose dviejose plokštėse yra dideli glialiniai tinklai, kurių baltymai yra nuosekliai reguliuojami abiejuose skyriuose (S5, C ir D pav.).
Atminkite, kad šios tendencijos būdingos ne visiems šių skydelių žymekliams. Pavyzdžiui, sinapsinėje skydelyje yra keli baltymai, kurių AD smegenyse ir CSF žymiai sumažėja (S5A pav.). Tarp šių nepakankamai reguliuojamų smegenų skysčio žymenų yra M1 NPTX2 ir VGF bei M12 chromograninas B. Tačiau, nepaisant šių išimčių, dauguma mūsų sinapsinių žymenų yra padidėję AD stuburo skystyje. Apskritai šios analizės sugebėjo atskirti statistiškai reikšmingas smegenų ir smegenų skysčio lygio tendencijas kiekvienoje iš penkių grupių. Šios tendencijos pabrėžia sudėtingą ir dažnai skirtingą ryšį tarp smegenų ir CSF baltymų ekspresijos sergant AD.
Tada mes panaudojome didelio našumo MS replikacijos analizę (CSF replikacija 1), kad susiaurintume savo 271 biomarkerių rinkinį iki perspektyviausių ir atkuriamiausių tikslų (5A pav.). CSF 1 kopijoje iš viso yra 96 Emory Goizueta ADRC mėginiai, įskaitant kontrolinę, AsymAD ir AD grupę (S1A lentelė). Šiems AD atvejams būdingas lengvas kognityvinis susilpnėjimas (vidurkis MoCA, 20,0 ± 3,8) ir AD biomarkerių pokyčiai, patvirtinti smegenų skystyje (S1A lentelė). Priešingai nei mes nustatėme CSF analizę, ši replikacija atliekama naudojant efektyvesnį ir didesnio našumo „vieno kadro“ MS metodą (be neprisijungusio frakcionavimo), įskaitant supaprastintą mėginių paruošimo protokolą, kuris pašalina atskirų mėginių imuninės sistemos išeikvojimo poreikį. . Vietoj to, norint sustiprinti mažiau gausių baltymų signalą, naudojamas vienas nusilpusio imuniteto „stiprinimo kanalas“ (37). Nors tai sumažina bendrą proteomo aprėptį, šis vieno kadro metodas žymiai sumažina mašinos laiką ir padidina TMT pažymėtų mėginių, kurie gali būti išanalizuoti, skaičių (17, 38). Iš viso analizė nustatė 6 487 peptidus, kurie 96 atvejais susiejo su 1 183 proteomais. Kaip ir CSF analizėje, mes nustatėme, kad į vėlesnius skaičiavimus buvo įtraukti tik tie baltymai, kurių kiekis buvo nustatytas mažiausiai 50% mėginių, o duomenys buvo regresuoti atsižvelgiant į amžiaus ir lyties poveikį. Tai leido galutinai įvertinti 792 proteomus, iš kurių 95% taip pat buvo nustatyti rasta CSF duomenų rinkinyje.
(A) Su smegenimis susiję CSF baltymų taikiniai, patikrinti pirmojoje kartotoje CSF grupėje ir įtraukti į galutinę grupę (n = 60). (B–E) Skydelio biožymenų lygiai (sudėtiniai z balai), išmatuoti keturiose CSF replikacijos grupėse. Suporuoti t testai arba ANOVA su Tukey postkorekcija buvo naudojami statistiniam gausos pokyčių reikšmingumui įvertinti kiekvienos kartotinės analizės metu. KT, kontrolė.
Kadangi esame ypač suinteresuoti patikrinti mūsų 271 su smegenimis susijusį CSF taikinį atlikdami išsamią analizę, toliau tirsime šį pakartotą proteomą šiais žymenimis. Iš šių 271 baltymo 100 buvo aptikti CSF replikacijoje 1. S6A paveiksle parodyta skirtinga šių 100 persidengiančių žymenų ekspresija tarp kontrolinių ir AD replikacijos mėginių. Sergant AD labiausiai padaugėja sinapsinių ir metabolitų histonų, o sergant ligomis kraujagyslinių baltymų mažėja. Dauguma 100 persidengiančių žymenų (n = 70) išlaikė tą pačią pokyčių kryptį dviejuose duomenų rinkiniuose (S6B pav.). Šie 70 patvirtintų su smegenimis susijusių CSF žymenų (S2H lentelė) iš esmės atspindi anksčiau pastebėtas skydelio ekspresijos tendencijas, ty kraujagyslių baltymų sumažėjimą ir visų kitų skydelių reguliavimą. Tik 10 iš šių 70 patvirtintų baltymų parodė AD gausos pokyčius, kurie prieštarauja šioms skydelio tendencijoms. Siekdami sukurti skydelį, kuris geriausiai atspindi bendrą smegenų ir smegenų skysčio tendenciją, išskyrėme šiuos 10 baltymų iš dominančios grupės, kurią galiausiai patikrinome (5A pav.). Todėl mūsų grupėje iš viso yra 60 baltymų, patikrintų dviejose nepriklausomose CSF AD grupėse, naudojant skirtingą mėginių paruošimą ir MS platformos analizę. Šių galutinių skydelių z balo išraiškos diagramos CSF 1 kopijos kontrolinėje ir AD atvejais patvirtino skydelio tendenciją, pastebėtą mūsų aptiktoje CSF grupėje (5B pav.).
Tarp šių 60 baltymų yra molekulių, kurios, kaip žinoma, yra susijusios su AD, pvz., osteopontinas (SPP1), kuris yra priešuždegiminis citokinas, kuris daugelyje tyrimų buvo siejamas su AD (39–41), ir GAP43, A sinaptinis baltymas. kuris yra aiškiai susijęs su neurodegeneracija (42). Labiausiai patikrinti baltymai yra žymenys, susiję su kitomis neurodegeneracinėmis ligomis, tokiomis kaip su amiotrofine lateraline skleroze (ALS) susijusi superoksido dismutazė 1 (SOD1) ir su Parkinsono liga susijusi dezacharazė (PARK7). Taip pat patikrinome, kad daugelis kitų žymenų, tokių kaip SMOC1 ir daug smegenų turintis membranos prijungimo signalinis baltymas 1 (BASP1), turi ribotą ankstesnį ryšį su neurodegeneracija. Verta paminėti, kad dėl mažo jų bendro gausumo CSF proteome mums sunku naudoti šį didelio našumo vieno kadro aptikimo metodą, kad būtų galima patikimai aptikti MAPT ir tam tikrus kitus su AD susijusius baltymus (pavyzdžiui, NEFL ir NRGN). ) ( 43, 44).
Tada mes patikrinome šiuos 60 prioritetinių skydelių žymeklių trijose papildomose kartotinėse analizėse. CSF 2 kopijoje mes naudojome vieną TMT-MS, kad išanalizuoti nepriklausomą 297 kontrolinių ir AD mėginių grupę iš Emory Goizueta ADRC (17). 3 CSF replikacija apėmė turimų 120 kontrolinių ir AD pacientų iš Lozanos (Šveicarija) TMT-MS duomenų pakartotinę analizę (45). Kiekviename duomenų rinkinyje aptikome daugiau nei du trečdalius iš 60 prioritetinių žymeklių. Nors Šveicarijos tyrime buvo naudojamos skirtingos MS platformos ir TMT kiekybinio nustatymo metodai (45, 46), mes stipriai atkartojome savo skydelio tendencijas dviejose kartotinėse analizėse (5 paveikslas, C ir D bei S2, I ir J lentelės). Norėdami įvertinti mūsų grupės ligos specifiškumą, mes panaudojome TMT-MS analizuodami ketvirtąjį replikacijos duomenų rinkinį (CSF replikacija 4), kuris apėmė ne tik kontrolinius (n = 18) ir AD (n = 17) atvejus, bet ir PD ( n = 14), ALS (n = 18) ir frontotemporalinės demencijos (FTD) mėginiai (n = 11) (S1A lentelė). Sėkmingai kiekybiškai įvertinome beveik du trečdalius šios kohortos skydo baltymų (38 iš 60). Šie rezultatai pabrėžia AD specifinius pokyčius visose penkiose biologinių žymenų plokštėse (5E paveikslas ir S2K lentelė). Metabolitų grupės padidėjimas parodė stipriausią AD specifiškumą, po to sekė mielinizacijos ir glijos grupė. Mažesniu mastu STD taip pat rodo padidėjimą tarp šių skydelių, o tai gali atspindėti panašius galimus tinklo pokyčius (17). Priešingai, ALS ir PD parodė beveik tuos pačius mielinizacijos, glijos ir metabolomų profilius kaip ir kontrolinė grupė. Apskritai, nepaisant mėginių paruošimo, MS platformos ir TMT kiekybinio nustatymo metodų skirtumų, šios pakartotinės analizės rodo, kad mūsų prioritetiniai skydelio žymenys turi labai nuoseklius AD specifinius pokyčius daugiau nei 500 unikalių CSF mėginių.
AD neurodegeneracija buvo plačiai pripažinta kelerius metus iki pažintinių simptomų atsiradimo, todėl skubiai reikia AsymAD biomarkerių (5, 31). Tačiau vis daugiau įrodymų rodo, kad AsymAD biologija toli gražu nėra vienalytė, o sudėtinga rizikos ir atsparumo sąveika lemia didelius individualius tolesnio ligos progresavimo skirtumus (47). Nors ir buvo naudojami AsymAD atvejams nustatyti, pagrindinių CSF biomarkerių (Aβ1-42, bendrojo tau ir p-tau) lygiai neįrodė, kad būtų galima patikimai numatyti, kam progresuos demencija (4, 7), o tai rodo daugiau. būtina įtraukti holistinius biologinių žymenų įrankius, pagrįstus keliais smegenų fiziologijos aspektais, kad būtų galima tiksliai stratifikuoti šios populiacijos riziką. Todėl vėliau išanalizavome savo AD patvirtintą biožymenų skydelį 1-osios CSF kopijos AsymAD populiacijoje. Šie 31 AsymAD atvejai parodė nenormalų pagrindinių biomarkerių lygį (Aβ1–42/bendras tau ELISA santykis, <5,5) ir visišką pažinimą (vidurkis MoCA, 27,1). ± 2,2) (S1A lentelė). Be to, visų AsymAD sergančių asmenų klinikinis demencijos balas yra 0, o tai rodo, kad nėra įrodymų, kad kasdienės pažinimo ar funkcinės veiklos sumažėjo.
Pirmiausia išanalizavome patvirtintų plokščių lygius visuose 96 CSF pakartojimuose 1, įskaitant AsymAD kohortą. Mes nustatėme, kad kelios AsymAD grupės plokštės turėjo reikšmingų į AD panašių gausos pokyčių, kraujagyslių skydelis parodė AsymAD mažėjimo tendenciją, o visos kitos plokštės rodė didėjimo tendenciją (6A pav.). Todėl visos plokštės parodė labai reikšmingą koreliaciją su ELISA Aβ1-42 ir bendru tau lygiu (6B pav.). Priešingai, koreliacija tarp grupės ir MoCA balo yra gana menka. Vienas iš ryškesnių šių analizių išvadų yra didelis skydelių gausos asortimentas AsymAD kohortoje. Kaip parodyta 6A paveiksle, AsymAD grupės skydelio lygis paprastai kerta kontrolinės grupės ir AD grupės skydelio lygį, o tai rodo gana didelį kintamumą. Norėdami toliau ištirti šį AsymAD nevienalytiškumą, taikėme daugiamačio mastelio (MDS) analizę 96 CSF replikacijos 1 atvejams. MDS analizė leidžia vizualizuoti atvejų panašumą pagal tam tikrus duomenų rinkinio kintamuosius. Šiai klasterinei analizei naudojame tik tuos patvirtintus skydelio žymenis, kurie turi statistiškai reikšmingą pokytį (P <0,05, AD/kontrolė) CSF atradimo ir replikacijos 1 proteomo (n = 29) (S2L lentelė) lygyje. Ši analizė parodė aiškų erdvinį grupavimą tarp mūsų kontrolės ir AD atvejų (6C pav.). Priešingai, kai kurie AsymAD atvejai aiškiai suskirstyti į kontrolinę grupę, o kiti yra AD atvejais. Norėdami toliau ištirti šį AsymAD nevienalytiškumą, naudojome savo MDS žemėlapį, kad apibrėžtume dvi šių AsymAD atvejų grupes. Pirmoji grupė apėmė AsymAD atvejus, sugrupuotus arčiau kontrolės (n = 19), o antrajai grupei buvo būdingi AsymAD atvejai, kurių žymeklio profilis buvo arčiau AD (n = 12).
(A) CSF biomarkerių grupės ekspresijos lygis (z balas) visuose 96 mėginiuose CSF replikacijos 1 kohortoje, įskaitant AsymAD. Skydelių gausos pokyčių statistiniam reikšmingumui įvertinti buvo naudojama dispersijos analizė su Tukey postkorekcija. (B) Koreliacijos analizė skydelio baltymų gausos lygiu (z-balas) su MoCA balu ir bendru tau lygiu ELISA Aβ1-42 ir CSF 1 kopijos mėginiuose. Rodomas Pearsono koreliacijos koeficientas su atitinkama P reikšme. (C) 96 CSF 1 kopijos atvejų MDS buvo pagrįstas 29 patvirtintų skydelio žymenų gausos lygiais, kurie buvo reikšmingai pakeisti tiek atradimo, tiek CSF 1 kopijos duomenų rinkiniuose [P <0,05 AD / kontrolė (CT)]. Ši analizė buvo naudojama padalyti AsymAD grupę į kontrolinius (n = 19) ir AD (n = 12) pogrupius. (D) Vulkano diagrama rodo skirtingą visų CSF replikacijos 1 baltymų ekspresiją su log2 karto pokyčiu (x ašis), palyginti su -log10 statistine P verte tarp dviejų AsymAD pogrupių. Skydelių biomarkeriai yra spalvoti. (E) Atrankos grupės biomarkerių CSF replikacijos 1 gausos lygis yra skirtingai išreikštas AsymAD pogrupiuose. Statistiniam reikšmingumui įvertinti buvo naudojama Tukey po pakoreguota dispersijos analizė.
Ištyrėme skirtingą baltymų ekspresiją tarp šių kontrolinių ir į AD panašių AsymAD atvejų (6D pav. ir S2L lentelė). Gautas ugnikalnio žemėlapis rodo, kad 14 skydelių žymeklių labai pasikeitė tarp dviejų grupių. Dauguma šių žymenų yra sinapsės ir metabolizmo nariai. Tačiau šiai grupei taip pat priklauso SOD1 ir miristoilintas alanino turtingas baltymų kinazės C substratas (MARCKS), kurie yra atitinkamai mielino ir glialinės imuninės grupės nariai (6 pav., D ir E). Kraujagyslių skydelyje taip pat buvo du žymenys, kurie buvo žymiai sumažinti į AD panašioje AsymAD grupėje, įskaitant AE surišantį baltymą 1 (AEBP1) ir komplemento šeimos narį C9. Nebuvo reikšmingo skirtumo tarp kontrolinių ir į AD panašių AsymAD pogrupių ELISA AB1-42 (P = 0,38) ir p-tau (P = 0,28), tačiau iš tikrųjų buvo reikšmingas skirtumas tarp bendro tau lygio (P = 0,0031). ) (S7 pav.). Yra keletas skydelio žymenų, rodančių, kad pokyčiai tarp dviejų AsymAD pogrupių yra reikšmingesni už bendrą tau lygį (pavyzdžiui, YWHAZ, SOD1 ir MDH1) (6E pav.). Apskritai šie rezultatai rodo, kad mūsų patvirtintoje grupėje gali būti biomarkerių, kurie gali suskirstyti pacientus, sergančius besimptome liga, suskirstyti į pogrupius ir galimą rizikos stratifikaciją.
Skubiai reikia sisteminių biologinių žymenų įrankių, kad būtų galima geriau išmatuoti ir nukreipti įvairią AD patofiziologiją. Tikimasi, kad šios priemonės ne tik pakeis mūsų AD diagnostikos sistemą, bet ir skatins taikyti veiksmingas, konkrečiam pacientui skirtas gydymo strategijas (1, 2). Šiuo tikslu AD smegenims ir CSF taikėme nešališką visapusišką proteomikos metodą, kad nustatytume internetinius CSF biomarkerius, atspindinčius platų smegenų patofiziologijos spektrą. Mūsų analizė sukūrė penkias CSF biomarkerių plokštes, kurios (i) atspindi sinapses, kraujagysles, mieliną, imuninę ir metabolinę disfunkciją; ii) demonstruoja didelį atkuriamumą įvairiose MS platformose; (iii) Parodykite progresuojančius ligai būdingus pokyčius ankstyvosiose ir vėlyvosiose AD stadijose. Apskritai šios išvados yra daug žadantis žingsnis kuriant įvairius, patikimus, į internetą orientuotus biomarkerių įrankius AD tyrimams ir klinikinėms programoms.
Mūsų rezultatai rodo labai konservuotą AD smegenų tinklo proteomo organizaciją ir palaiko jo naudojimą kaip sisteminio biomarkerio kūrimo inkarą. Mūsų analizė rodo, kad du nepriklausomi TMT-MS duomenų rinkiniai, kuriuose yra AD ir AsymAD smegenys, turi stiprų moduliškumą. Šios išvados pratęsia mūsų ankstesnį darbą, parodydami, kad iš daugelio nepriklausomų priekinės, parietalinės ir laikinosios žievės grupių yra išsaugoti galingi daugiau nei 2000 smegenų audinių moduliai (17). Šis konsensuso tinklas atspindi įvairius su liga susijusius pokyčius, pastebėtus dabartiniuose tyrimuose, įskaitant glijos turtingų uždegiminių modulių padidėjimą ir neuronų turinčių modulių sumažėjimą. Kaip ir dabartiniai tyrimai, šiame didelio masto tinkle taip pat yra reikšmingų modulinių AsymAD pokyčių, rodančių įvairią ikiklinikinę patofiziologiją (17).
Tačiau šioje labai konservatyvioje sisteminėje sistemoje yra daugiau smulkiagrūdžio biologinio nevienalytiškumo, ypač tarp asmenų ankstyvosiose AD stadijose. Mūsų biomarkerių skydelis gali pavaizduoti du AsymAD pogrupius, kurie parodo reikšmingą kelių CSF žymenų skirtingą išraišką. Mūsų grupė sugebėjo pabrėžti šių dviejų pogrupių biologinius skirtumus, kurie nebuvo akivaizdūs pagrindinių AD biomarkerių lygiu. Palyginti su kontroline grupe, šių AsymAD asmenų Aβ1-42/bendras tau santykis buvo neįprastai mažas. Tačiau tik bendras tau lygis labai skyrėsi dviejuose AsymAD pogrupiuose, o Aβ1-42 ir p-tau lygiai išliko palyginti panašūs. Kadangi didelis CSF tau yra geresnis kognityvinių simptomų prognozuotojas nei Aβ1-42 lygis (7), manome, kad dvi AsymAD grupės gali turėti skirtingą ligos progresavimo riziką. Atsižvelgiant į ribotą mūsų AsymAD imties dydį ir išilginių duomenų trūkumą, norint patikimai padaryti šias išvadas, reikia atlikti tolesnius tyrimus. Tačiau šie rezultatai rodo, kad sisteminė CSF grupė gali pagerinti mūsų gebėjimą veiksmingai stratifikuoti asmenis besimptomėje ligos stadijoje.
Apskritai, mūsų išvados patvirtina daugelio biologinių funkcijų vaidmenį AD patogenezėje. Tačiau nereguliuojamas energijos metabolizmas tapo svarbia visų penkių patvirtintų ženklinimo lentelių tema. Metaboliniai baltymai, tokie kaip hipoksantino-guanino fosforiboziltransferazė 1 (HPRT1) ir laktato dehidrogenazė A (LDHA), yra tvirčiausiai patvirtinti sinapsiniai biomarkeriai, o tai rodo, kad AD CSF padidėjimas yra labai atkuriama lytis. Mūsų kraujagyslėse ir glijos plokštėse taip pat yra keletas žymenų, dalyvaujančių oksidacinių medžiagų metabolizme. Šios išvados atitinka pagrindinį vaidmenį, kurį medžiagų apykaitos procesai atlieka visose smegenyse, ne tik siekiant patenkinti didelį neuronų energijos poreikį, bet ir patenkinti didelį astrocitų ir kitų glijos ląstelių energijos poreikį (17, 48). Mūsų rezultatai patvirtina vis daugiau įrodymų, kad redokso potencialo pokyčiai ir energijos takų nutraukimas gali būti pagrindinis ryšys tarp kelių pagrindinių procesų, susijusių su AD patogeneze, įskaitant mitochondrijų sutrikimus, glijos sukeltą uždegimą ir kraujagyslių pažeidimus (49). Be to, medžiagų apykaitos smegenų skysčio biomarkeriuose yra daug skirtingai turtingų baltymų tarp mūsų kontrolinių ir į AD panašių AsymAD pogrupių, o tai rodo, kad šių energijos ir redokso takų sutrikimas gali būti labai svarbus ikiklinikinėje ligos stadijoje .
Mūsų pastebėtos skirtingos smegenų ir smegenų skysčio skydelio tendencijos taip pat turi įdomių biologinių pasekmių. Sinapsėse ir metabolomose, kuriose gausu neuronų, sumažėja AD smegenyse ir padidėja smegenų skysčio kiekis. Atsižvelgiant į tai, kad neuronuose yra daug energiją gaminančių mitochondrijų sinapsėse, kad būtų tiekiama energija daugeliui specializuotų signalų (50), tikimasi, kad šių dviejų neuronų grupių ekspresijos profiliai bus panašūs. Neuronų praradimas ir pažeistų ląstelių išspaudimas gali paaiškinti šias smegenų ir CSF skydelio tendencijas vėlesnėse ligose, tačiau jie negali paaiškinti ankstyvųjų skydelio pokyčių, kuriuos stebime (13). Vienas iš galimų šių ankstyvosios besimptomės ligos požymių paaiškinimų yra nenormalus sinapsinis genėjimas. Nauji pelių modelių įrodymai rodo, kad mikroglijų sukelta sinapsinė fagocitozė gali būti nenormaliai aktyvuota sergant AD ir sukelti ankstyvą sinapsės praradimą smegenyse (51). Ši išmesta sinaptinė medžiaga gali kauptis CSF, todėl stebime CSF padidėjimą neuronų skydelyje. Imuninės sistemos sukeltas sinapsinis genėjimas taip pat gali iš dalies paaiškinti glijos baltymų padidėjimą, kurį stebime smegenyse ir smegenų skystyje per visą ligos procesą. Be sinapsinio genėjimo, bendri egzocitų kelio anomalijos taip pat gali lemti skirtingas neuronų žymenų smegenų ir CSF išraiškas. Daugybė tyrimų parodė, kad AD smegenų patogenezėje egzosomų turinys pasikeitė (52). Tarpląstelinis kelias taip pat dalyvauja Aβ proliferacijoje (53, 54). Verta paminėti, kad egzosominės sekrecijos slopinimas gali sumažinti į AD panašią patologiją AD transgeninių pelių modeliuose (55).
Tuo pačiu metu kraujagyslių skydelyje esantis baltymas vidutiniškai padidėjo AD smegenyse, tačiau žymiai sumažėjo CSF. Kraujo ir smegenų barjero (BBB) disfunkcija iš dalies gali paaiškinti šias išvadas. Daugelis nepriklausomų pomirtinių tyrimų su žmonėmis parodė BBB skilimą sergant AD (56, 57). Šie tyrimai patvirtino įvairią nenormalią veiklą, susijusią su šiuo sandariai uždarytu endotelio ląstelių sluoksniu, įskaitant smegenų kapiliarų nutekėjimą ir kraujo baltymų kaupimąsi perivaskuliniame kraujuje (57). Tai gali būti paprastas paaiškinimas dėl padidėjusio kraujagyslių baltymų kiekio smegenyse, tačiau negali visiškai paaiškinti tų pačių baltymų išeikvojimo smegenų skystyje. Viena iš galimybių yra ta, kad centrinė nervų sistema aktyviai izoliuoja šias molekules, kad išspręstų padidėjusio uždegimo ir oksidacinio streso problemą. Kai kurių sunkiausių CSF baltymų kiekio sumažėjimas šioje grupėje, ypač dalyvaujančių lipoproteinų reguliavime, yra susijęs su žalingo uždegimo lygio slopinimu ir reaktyviųjų deguonies rūšių neuroprotekciniu procesu. Tai pasakytina apie paroksonazę 1 (PON1), lipoproteinus surišantį fermentą, atsakingą už oksidacinio streso lygio mažinimą kraujotakoje (58, 59). Alfa-1-mikroglobulino / bikunino pirmtakas (AMBP) yra dar vienas žymiai sumažintas kraujagyslių grupės žymuo. Tai yra lipidų transporterio bikunino pirmtakas, kuris taip pat dalyvauja slopinant uždegimą ir neurologinę apsaugą (60, 61).
Nepaisant įvairių įdomių hipotezių, nesugebėjimas tiesiogiai aptikti biocheminių ligų mechanizmų yra gerai žinomas atradimu pagrįstos proteomikos analizės apribojimas. Todėl reikia atlikti tolesnius tyrimus, kad būtų galima patikimai apibrėžti šių biologinių žymenų plokščių mechanizmus. Siekiant pereiti prie IS pagrįstos klinikinės analizės kūrimo, ateities kryptis taip pat reikalauja, kad būtų naudojami tiksliniai kiekybiniai didelio masto biožymenų tikrinimo metodai, pavyzdžiui, selektyvus arba lygiagretus reakcijos stebėjimas (62). Neseniai naudojome lygiagretų reakcijos stebėjimą (63), kad patvirtintume daugelį čia aprašytų CSF baltymų pokyčių. Keli prioritetiniai skydelio tikslai yra kiekybiškai įvertinti labai tiksliai, įskaitant YWHAZ, ALDOA ir SMOC1, kurie atitinkamai atitinka mūsų sinapsės, metabolizmo ir uždegimo plokštes (63). Nepriklausomas duomenų gavimas (DIA) ir kitos MS pagrįstos strategijos taip pat gali būti naudingos tikslinei patikrai. Bud ir kt. (64) Neseniai buvo įrodyta, kad mūsų CSF atradimo duomenų rinkinyje nustatyti AD biomarkeriai ir nepriklausomas DIA-MS duomenų rinkinys, kurį sudaro beveik 200 CSF mėginių iš trijų skirtingų Europos grupių, labai sutampa. Šie naujausi tyrimai patvirtina mūsų skydų potencialą paversti patikimu MS pagrįstu aptikimu. Tradicinis antikūnų ir aptamerų aptikimas taip pat yra svarbus tolesniam pagrindinių AD biomarkerių kūrimui. Dėl mažo CSF gausumo šiuos biomarkerius sunkiau aptikti naudojant didelio našumo MS metodus. NEFL ir NRGN yra du mažo gausumo CSF biomarkerių pavyzdžiai, kurie mūsų išsamioje analizėje yra susieti su skydeliu, tačiau negali būti patikimai aptikti naudojant mūsų vieną MS strategiją. Taikymo strategijos, pagrįstos keliais antikūnais, tokiais kaip PEA, gali paskatinti klinikinę šių žymenų transformaciją.
Apskritai šis tyrimas suteikia unikalų proteomikos metodą, skirtą CSF AD biomarkeriams identifikuoti ir patikrinti, remiantis skirtingomis sistemomis. Šių žymenų skydelių optimizavimas papildomose AD grupėse ir MS platformose gali pasirodyti daug žadantis, kad padidėtų AD rizikos stratifikacija ir gydymas. Tyrimai, kuriuose vertinamas išilginis šių plokščių lygis laikui bėgant, taip pat yra labai svarbūs siekiant nustatyti, kuris žymenų derinys geriausiai išskiria ankstyvos ligos riziką ir ligos sunkumo pokyčius.
Išskyrus 3 CSF nukopijuotus mėginius, visi šiame tyrime naudojami CSF mėginiai buvo paimti globojant Emory ADRC arba glaudžiai susijusias tyrimų institucijas. Iš viso šiuose proteomikos tyrimuose buvo naudojami keturi Emory CSF mėginių rinkiniai. Nustatyta, kad CSF grupėje buvo mėginiai iš 20 sveikų kontrolinių asmenų ir 20 AD pacientų. CSF 1 kopijoje yra mėginiai iš 32 sveikų kontrolinių asmenų, 31 AsymAD asmens ir 33 AD asmenų. CSF 2 kopijoje yra 147 kontrolinės medžiagos ir 150 AD mėginių. Kelių ligų CSF replikacijos 4 grupė apėmė 18 kontrolinių, 17 AD, 19 ALS, 13 PD ir 11 FTD mėginių. Pagal Emory universiteto Institucinės peržiūros tarybos patvirtintą susitarimą visi Emory tyrimo dalyviai gavo informuotą sutikimą. Remiantis 2014 m. Nacionalinio senėjimo instituto Alzheimerio centrų geriausios praktikos gairėmis (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), cerebrospinalinis skystis buvo renkamas ir saugomas juosmens punkcija. Kontrolės ir AsymAD bei AD pacientai gavo standartizuotą kognityvinį vertinimą Emory kognityvinės neurologijos klinikoje arba Goizueta ADRC. Jų smegenų skysčio mėginiai buvo ištirti INNO-BIA AlzBio3 Luminex ELISA Aβ1-42, bendrojo tau ir p-tau analizei (65). ELISA vertės naudojamos siekiant paremti diagnostinę tiriamųjų klasifikaciją, remiantis nustatytais AD biomarkerio ribiniais kriterijais (66, 67). Pagrindiniai demografiniai ir diagnostiniai kitų CSF diagnozių (FTD, ALS ir PD) duomenys taip pat gaunami iš Emory ADRC arba susijusių tyrimų institucijų. Šių Emory CSF atvejų metaduomenų santrauką galima rasti S1A lentelėje. Šveicarijos CSF replikacijos 3 kohortos charakteristikos buvo paskelbtos anksčiau (45).
CSF rado pavyzdį. Siekiant padidinti mūsų CSF duomenų rinkinio atradimo gylį, prieš tripsinizaciją buvo atliktas didelio gausumo baltymų suvartojimas. Trumpai tariant, 130 μl CSF iš 40 atskirų CSF mėginių ir vienodo tūrio (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) buvo patalpinta į sukimo kolonėlę (Thermo Fisher Scientific, A89868) kambaryje. temperatūra Inkubuoti). Pasukę mėginį 15 minučių, centrifuguokite 1000 g 2 minutes. 3K ultracentrifuginis filtro įtaisas (Millipore, UFC500396) buvo naudojamas nuotekų mėginiui koncentruoti, centrifuguojant 14 000 g 30 minučių. Praskieskite visus mėginio tūrius iki 75 μl fosfatiniu buferiniu tirpalu. Baltymų koncentracija buvo įvertinta bicinchonino rūgšties (BCA) metodu pagal gamintojo protokolą (Thermo Fisher Scientific). Iš visų 40 mėginių nuskurdintas CSF (60 μl) buvo suardytas lizilo endopeptidaze (LysC) ir tripsinu. Trumpai tariant, mėginys buvo redukuotas ir alkilintas 1,2 μl 0,5 M tris-2(-karboksietil)-fosfino ir 3 μl 0,8 M chloracetamido 90 ° C temperatūroje 10 minučių, o po to 15 minučių ultragarsu apdorojamas vandens vonioje. Mėginys praskiedžiamas 193 μl 8 M karbamido buferio [8 M karbamido ir 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] iki galutinės 6 M karbamido koncentracijos. LysC (4,5 μg; Wako) naudojamas virškinimui per naktį kambario temperatūroje. Tada mėginys buvo atskiestas iki 1 M karbamido su 50 mM amonio bikarbonatu (ABC) (68). Įpilkite vienodą kiekį (4,5 μg) tripsino (Promega) ir inkubuokite mėginį 12 valandų. Suskaidytą peptido tirpalą parūgštinkite iki galutinės 1 % skruzdžių rūgšties (FA) ir 0,1 % trifluoracto rūgšties (TFA) koncentracijos (66), o po to nušalinkite druską naudodami 50 mg Sep-Pak C18 kolonėlę (Waters), kaip aprašyta aukščiau (25). . Tada peptidas buvo išplautas 1 ml 50% acetonitrilo (ACN). Norint standartizuoti baltymų kiekybinį nustatymą partijose (25), 100 μl alikvotinės dalys iš visų 40 CSF mėginių buvo sujungtos, kad būtų gautas mišrus mėginys, kuris vėliau buvo padalintas į penkis pasaulinio vidinio standarto (GIS) (48) mėginius. Visi atskiri mėginiai ir kombinuoti etalonai džiovinami didelio greičio vakuumu (Labconco).
CSF nukopijuoja pavyzdį. Dayonas ir jo kolegos anksčiau aprašė imuninės sistemos išsekimą ir 3-iosios CSF kopijos mėginių virškinimą (45, 46). Likę kartotiniai mėginiai nebuvo individualiai nusilpę. Suvirškinkite šiuos nepašalintus mėginius tripsine, kaip aprašyta anksčiau (17). Kiekvienai pakartotinei analizei 120 μl eliuuoto peptido alikvotinės dalys iš kiekvieno mėginio buvo sujungtos ir padalintos į vienodo tūrio alikvotas, kad būtų galima naudoti kaip TMT pažymėtą pasaulinį vidinį standartą (48). Visi atskiri mėginiai ir kombinuoti etalonai džiovinami didelio greičio vakuumu (Labconco). Siekiant sustiprinti mažai gausaus CSF baltymo signalą, sujungiant 125 μl iš kiekvieno mėginio, kiekvienai pakartotinei analizei buvo paruoštas „patobulintas“ mėginys [ty biologinis mėginys, imituojantis tiriamąjį mėginį, tačiau turimas kiekis yra daug didesnis (37, 69)] sujungtas į mišrų CSF mėginį (17). Tada sumaišytas mėginys buvo imuniškai pašalintas naudojant 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), suardomas, kaip aprašyta aukščiau, ir įtrauktas į vėlesnį daugkartinį TMT ženklinimą.
Paskelbimo laikas: 2021-08-27