Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Termofilai yra mikroorganizmai, kurie klesti aukštoje temperatūroje. Jų studijavimas gali suteikti vertingos informacijos apie tai, kaip gyvenimas prisitaiko prie ekstremalių sąlygų. Tačiau naudojant įprastus optinius mikroskopus sunku pasiekti aukštos temperatūros sąlygas. Buvo pasiūlyta keletas namuose sukurtų sprendimų, pagrįstų vietiniu varžiniu šildymu, tačiau paprasto komercinio sprendimo nėra. Šiame darbe pristatome mikroskopinio lazerinio šildymo virš mikroskopo regėjimo lauko koncepciją, kad termofiliniams tyrimams būtų užtikrinta aukšta temperatūra, kartu išlaikant švelnią vartotojo aplinką. Mikroskalinis šildymas vidutinio intensyvumo lazeriu gali būti pasiektas naudojant aukso nanodalelėmis dengtą substratą kaip biologiškai suderinamą ir efektyvų šviesos sugėriklį. Aptariamas galimas mikroskopinio skysčio konvekcijos, ląstelių sulaikymo ir išcentrinio termoforetinio judėjimo poveikis. Šis metodas buvo įrodytas naudojant dvi rūšis: (i) Geobacillus stearothermophilus, aktyvią termofilinę bakteriją, kuri dauginasi maždaug 65 °C temperatūroje, kuri, kaip mes pastebėjome, dygsta, auga ir plaukia kaitinant mikroskopu; (ii) Thiobacillus sp., optimaliai hipertermofilinė archėja. 80°C temperatūroje. Šis darbas atveria kelią paprastam ir saugiam termofilinių mikroorganizmų stebėjimui naudojant modernias ir prieinamas mikroskopijos priemones.
Per milijardus metų gyvybė Žemėje išsivystė, kad prisitaikytų prie įvairiausių aplinkos sąlygų, kurios kartais laikomos ekstremaliomis iš mūsų žmogaus perspektyvos. Visų pirma, kai kurie termofiliniai mikroorganizmai (bakterijos, archėjos, grybai), vadinami termofilais, klesti temperatūros diapazone nuo 45°C iki 122°C1, 2, 3, 4. Termofilai gyvena įvairiose ekosistemose, pavyzdžiui, giliavandenėse hidroterminėse angose, karštosiose versmėse. arba vulkaninės zonos. Jų tyrimai per pastaruosius kelis dešimtmečius sukėlė didelį susidomėjimą mažiausiai dėl dviejų priežasčių. Pirma, iš jų galime pasimokyti, pavyzdžiui, kaip termofilai 5, 6, fermentai 7, 8 ir membranos 9 yra stabilūs esant tokioms aukštoms temperatūroms arba kaip termofilai gali atlaikyti ekstremalias radiacijas10. Antra, jie yra daugelio svarbių biotechnologinių pritaikymų1,11,12 pagrindas, pavyzdžiui, kuro gamyba13,14,15,16, cheminė sintezė (dihidro, alkoholiai, metanas, aminorūgštys ir kt.)17, biokasyba18 ir termostabilūs biokatalizatoriai7,11, 13. Visų pirma, šiuo metu gerai žinoma polimerazės grandininė reakcija (PGR)19 apima fermentą (Taq polimerazę), išskirtą iš termofilinės bakterijos Thermus aquaticus, vienos iš pirmųjų atrastų termofilų.
Tačiau termofilų tyrimas nėra lengvas uždavinys ir jo negalima improvizuoti jokioje biologinėje laboratorijoje. Visų pirma, gyvi termofilai negali būti stebimi in vitro su jokiu standartiniu šviesos mikroskopu, net ir su prekyboje esančiomis šildymo kameromis, kurios paprastai vertinamos net 40 °C temperatūroje. Nuo 1990-ųjų tik kelios tyrimų grupės pasišventė aukštos temperatūros mikroskopijos (HTM) sistemų diegimui. 1994 m. Glukh ir kt. Šildymo / aušinimo kamera buvo sukurta naudojant Peltier kamerą, kuri kontroliuoja uždarų stačiakampių kapiliarų temperatūrą, kad būtų išlaikytas anaerobiškumas 20 . Prietaisas gali būti kaitinamas iki 100 °C 2 °C/s greičiu, todėl autoriai gali ištirti hipertermofilinės bakterijos Thermotoga maritima21 judrumą. 1999 m. Horn ir kt. Buvo sukurtas labai panašus prietaisas, vis dar pagrįstas šildomų kapiliarų, tinkamų komercinei mikroskopijai, naudojimu tiriant ląstelių dalijimąsi/jungimąsi. Po ilgo santykinio neveiklumo laikotarpio veiksmingų HTM paieška buvo atnaujinta 2012 m., visų pirma dėl Wirth grupės straipsnių, kuriuose buvo naudojamas Horno ir kt. išrastas įrenginys. Prieš penkiolika metų daugelio archejų, įskaitant hipertermofilus, judrumas buvo tiriamas iki 100 °C temperatūroje, naudojant šildomus kapiliarus23,24. Jie taip pat modifikavo pradinį mikroskopą, kad greičiau įkaistų (kelios minutės, o ne 35 minutės, kad pasiektų nustatytą temperatūrą) ir pasiektų linijinį temperatūros gradientą, didesnį nei 2 cm visoje terpėje. Šis temperatūros gradiento formavimo įrenginys (TGFD) buvo naudojamas daugelio termofilų mobilumui tirti temperatūros gradientuose biologiškai svarbiais atstumais 24, 25 .
Uždarų kapiliarų šildymas nėra vienintelis būdas stebėti gyvus termofilus. 2012 metais Kuwabara ir kt. Naudotos naminės vienkartinės Pyrex kameros, užplombuotos karščiui atspariais klijais (Super X2; Cemedine, Japonija). Mėginiai buvo dedami ant komerciškai prieinamos skaidrios kaitinimo plokštės (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japonija), galinčios šildyti iki 110 ° C, bet iš pradžių nebuvo skirtos biologiniam vaizdavimui. Autoriai stebėjo efektyvų anaerobinių termofilinių bakterijų (Thermosipho globiformans, padvigubėjimo laikas 24 min.) dalijimąsi 65°C temperatūroje. 2020 metais Pulshen ir kt. Efektyvus komercinių metalinių indų (AttofluorTM, Thermofisher) kaitinimas buvo demonstruojamas naudojant du naminius kaitinimo elementus: dangtį ir sceną (PGR aparato įkvėpta konfigūracija). Dėl šios asociacijos susidaro vienoda skysčio temperatūra ir neleidžiama išgaruoti bei kondensuotis dangčio apačioje. Naudojant sandarinimo žiedą išvengiama dujų mainų su aplinka. Šis HTM, vadinamas sulfoskopu, buvo naudojamas Sulfolobus acidocaldarius vaizdui 75 °C27 temperatūroje.
Pripažintas visų šių sistemų apribojimas buvo oro objektyvų naudojimo apribojimas, nes bet koks panardinimas į aliejų buvo netinkamas tokiai aukštai temperatūrai ir vaizdavimui per >1 mm storio skaidrius mėginius. Pripažintas visų šių sistemų apribojimas buvo oro objektyvų naudojimo apribojimas, nes bet koks panardinimas į aliejų buvo netinkamas tokiai aukštai temperatūrai ir vaizdavimui per >1 mm storio skaidrius mėginius. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективсков, погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачны через прозрачны Pripažintas visų šių sistemų trūkumas buvo oro objektyvų naudojimo apribojimas, nes bet koks panardinimas į aliejų nebuvo tinkamas tokiai aukštai temperatūrai ir vizualizacijai per skaidrius > 1 mm storio mėginius.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油镜，任何油浸都不适吂蚿都不适吂嚿毫米厚的透明样品成像. Pripažintas visų šių sistemų apribojimas yra apribojimas naudoti orą pritraukiamą veidrodį, nes bet koks panardinimas į aliejų yra netinkamas skaidriems > 1 mm storio mėginiams tokioje aukštoje temperatūroje vaizduoti. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушорных объвектиморных объектиморных ужение в масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозмрачные образцы нол1щицы нол1щих температур и визуализации через прозмрачные образцы. Pripažintas visų šių sistemų trūkumas yra ribotas oro lęšių naudojimas, bet koks panardinimas į aliejų netinka tokioms aukštoms temperatūroms ir vizualizacija per skaidrius >1 mm storio mėginius.Visai neseniai šį apribojimą panaikino Charles-Orzag ir kt. 28, kuris sukūrė įrenginį, kuris nebeteikia šilumos aplink dominančią sistemą, o paties dengiamojo stiklo viduje, padengtą plonu permatomu rezistoriaus sluoksniu, pagamintu iš ITO (indžio-alavo oksido). Dangtis gali būti įkaitintas iki 75 °C, praleidžiant elektros srovę per skaidrų sluoksnį. Tačiau autorius taip pat turi pašildyti objektyvą iki objektyvo, bet ne daugiau kaip 65 °C, kad jo nepažeistų.
Šie darbai rodo, kad veiksmingos aukštos temperatūros optinės mikroskopijos kūrimas nebuvo plačiai pritaikytas, dažnai reikalinga savadarbė įranga, o tai dažnai pasiekiama erdvinės skiriamosios gebos kaina, o tai yra rimtas trūkumas, atsižvelgiant į tai, kad termofilinių mikroorganizmų yra ne daugiau kaip keli. mikrometrų. Sumažintas šildymo tūris yra raktas į tris būdingas HTM problemas: prasta erdvinė skiriamoji geba, didelė šiluminė inercija, kai sistema įkaista, ir žalingas aplinkinių elementų (imersinės alyvos, objektyvo... ar vartotojo rankų) įkaitimas esant ekstremalioms temperatūroms. ).
Šiame darbe pristatome HTM termofiliniam stebėjimui, kuris nėra pagrįstas varžiniu šildymu. Vietoj to, mes pasiekėme lokalų šildymą ribotoje mikroskopo regėjimo lauko srityje, apšvitindami šviesą sugeriantį substratą lazeriu. Temperatūros pasiskirstymas buvo vizualizuotas naudojant kiekybinę fazės mikroskopiją (QPM). Šio metodo veiksmingumą demonstruoja Geobacillus stearothermophilus – judri termofilinė bakterija, kuri dauginasi maždaug 65°C temperatūroje ir turi trumpą padvigubėjimo laiką (apie 20 minučių), ir Sulfolobus shibatae – hipertermofilas, kuris optimaliai auga 80°C temperatūroje (archaea). iliustruoti. Normalus replikacijos greitis ir plaukimas buvo stebimi kaip temperatūros funkcija. Šio lazerio HTM (LA-HTM) neriboja dengiamojo stiklelio storis ar objektyvo pobūdis (panardinimas į orą ar aliejų). Tai leidžia naudoti bet kokį aukštos raiškos objektyvą rinkoje. Jis taip pat nenukenčia nuo lėto kaitinimo dėl šiluminės inercijos (pasiekia momentinį įkaitimą milisekundės mastu) ir naudoja tik komercinius komponentus. Vieninteliai nauji saugos klausimai yra susiję su galingų lazerio spindulių (paprastai iki 100 mW) buvimu įrenginio viduje ir galbūt per akis, kuriems reikia apsauginių akinių.
LA-HTM principas yra naudoti lazerį mėginiui šildyti lokaliai mikroskopo regėjimo lauke (1a pav.). Norėdami tai padaryti, mėginys turi sugerti šviesą. Norėdami naudoti pagrįstą lazerio galią (mažiau nei 100 mW), nepasitikėjome šviesos sugertimi skystoje terpėje, o dirbtinai padidinome mėginio sugertį, padengdami substratą aukso nanodalelėmis (1c pav.). Aukso nanodalelių šildymas šviesa yra labai svarbus šiluminės plazmonikos sričiai, kuri, kaip tikimasi, bus pritaikyta biomedicinoje, nanochemijoje ar saulės spindulių surinkime 29, 30, 31. Per pastaruosius kelerius metus šį LA-HTM naudojome keliuose tyrimuose, susijusiuose su terminės plazmos taikymu fizikoje, chemijoje ir biologijoje. Pagrindinis šio metodo sunkumas yra parodyti galutinį temperatūros profilį, nes padidinta temperatūra apsiriboja mikroskalės sritimi mėginyje. Mes parodėme, kad temperatūros atvaizdavimą galima pasiekti naudojant keturių bangų ilgio skersinį šlyties interferometrą, paprastą, didelės skiriamosios gebos ir labai jautrų kiekybinės fazės mikroskopijos metodą, pagrįstą dvimatėmis difrakcijos gardelėmis (taip pat žinomomis kaip kryžminės gardelės). 33,34,35,36. Šios šiluminės mikroskopijos metodo, pagrįsto kryžminės grotelės bangos fronto mikroskopija (CGM), patikimumas buvo įrodytas keliolikoje per pastarąjį dešimtmetį paskelbtų straipsnių37,38,39,40,41,42,43.
Lygiagretaus lazerinio šildymo, formavimo ir temperatūros mikroskopo įrengimo schema. b Pavyzdžio geometrija, sudaryta iš AttofluorTM kameros su dengiamuoju stikleliu, padengtu aukso nanodalelėmis. c Atidžiai pažiūrėkite į pavyzdį (ne pagal mastelį). d reiškia vienodą lazerio spindulio profilį ir (e) imituojamą tolesnį temperatūros pasiskirstymą aukso nanodalelių mėginio plokštumoje. f yra žiedinis lazerio pluošto profilis, tinkamas vienodai temperatūrai generuoti, kaip parodyta gauto temperatūros pasiskirstymo modeliavime, parodytame (g). Mastelio juosta: 30 µm.
Visų pirma, neseniai pasiekėme žinduolių ląstelių pašildymą naudojant LA-HTM ir CGM ir stebėjome ląstelių šilumos šoko reakcijas 37–42 ° C diapazone, parodydami šios technikos pritaikymą vienos gyvos ląstelės vaizdavimui. Tačiau LA-HTM pritaikymas tiriant mikroorganizmus aukštoje temperatūroje nėra vienareikšmis, nes reikalauja daugiau atsargumo, lyginant su žinduolių ląstelėmis: pirma, terpės dugną pakaitinus dešimtimis laipsnių (o ne keliais laipsniais) iki stipraus vertikalaus temperatūros gradiento. gali sukurti skysčio konvekciją 44, kuri, jei nėra tvirtai pritvirtinta prie pagrindo, gali sukelti nepageidaujamą judėjimą ir bakterijų susimaišymą. Šią konvekciją galima pašalinti sumažinus skysčio sluoksnio storį. Šiuo tikslu visuose toliau pateiktuose eksperimentuose bakterijų suspensijos buvo dedamos tarp dviejų maždaug 15 µm storio dengiamųjų stiklelių, įdėtų į metalinį puodelį (AttofluorTM, Thermofisher, 1b, c pav.). Iš esmės konvekcijos galima išvengti, jei skysčio storis yra mažesnis už kaitinimo lazerio pluošto dydį. Antra, dirbant tokioje ribotoje geometrijoje, gali uždusinti aerobiniai organizmai (žr. S2 pav.). Šios problemos galima išvengti naudojant deguoniui (ar bet kurioms kitoms gyvybiškai svarbioms dujoms) pralaidų pagrindą, dengiamajame stikle paliekant įstrigusius oro burbuliukus arba viršutiniame dengiamojo stiklelio išgręžiant skylutes (žr. S1 pav.) 45 . Šiame tyrime pasirinkome pastarąjį sprendimą (1b ir S1 pav.). Galiausiai lazerinis šildymas neužtikrina vienodo temperatūros pasiskirstymo. Net ir esant tokiam pačiam lazerio spindulio intensyvumui (1d pav.), temperatūros pasiskirstymas nėra vienodas, o veikiau primena Gauso pasiskirstymą dėl šiluminės difuzijos (1e pav.). Kai tikslas yra nustatyti tikslias temperatūras matymo lauke tiriant biologines sistemas, netolygūs profiliai nėra idealūs ir gali sukelti termoforetinį bakterijų judėjimą, jei jos neprilimpa prie pagrindo (žr. S3, S4 pav.)39. Šiuo tikslu panaudojome erdvinės šviesos moduliatorių (SLM), kad suformuotume infraraudonųjų spindulių lazerio spindulį pagal žiedo formą (1f pav.) mėginio plokštumoje, kad pasiektume visiškai vienodą temperatūros pasiskirstymą tam tikroje geometrinėje srityje. nepaisant šiluminės difuzijos (1d pav.) 39, 42, 46. Uždėkite viršutinį dengiamąjį stiklelį ant metalinio indo (1b pav.), kad terpė neišgaruotų, ir stebėkite bent kelias dienas. Kadangi šis viršutinis dengiantis stiklas nėra sandarus, prireikus bet kada galima lengvai pridėti papildomos terpės.
Siekdami iliustruoti, kaip veikia LA-HTM, ir parodyti jo pritaikomumą termofiliniams tyrimams, ištyrėme aerobines bakterijas Geobacillus stearothermophilus, kurių optimali augimo temperatūra yra apie 60–65°C. Bakterija taip pat turi žvynelių ir gebėjimą plaukti, o tai yra dar vienas normalios ląstelių veiklos rodiklis.
Mėginiai (1b pav.) buvo iš anksto inkubuojami 60 °C temperatūroje vieną valandą ir įdedami į LA-HTM mėginių laikiklį. Šis išankstinis inkubavimas yra neprivalomas, bet vis tiek naudingas dėl dviejų priežasčių: Pirma, kai įjungiamas lazeris, ląstelės iš karto auga ir dalijasi (žr. filmą M1 papildomose medžiagose). Be išankstinio inkubavimo, bakterijų augimas paprastai sulėtėja maždaug 40 minučių kiekvieną kartą, kai ant mėginio kaitinamas naujas stebėjimo plotas. Antra, 1 valandos išankstinis inkubavimas paskatino bakterijų sukibimą su dengiamuoju stikleliu, neleidžiant ląstelėms pasitraukti iš regėjimo lauko dėl termoforezės, kai buvo įjungtas lazeris (žr. filmą M2 papildomose medžiagose). Termoforezė yra dalelių ar molekulių judėjimas pagal temperatūros gradientą, paprastai nuo karšto iki šalto, ir bakterijos nėra išimtis43,47. Šis nepageidaujamas poveikis pašalinamas tam tikroje srityje naudojant SLM lazerio spinduliui formuoti ir pasiekti vienodą temperatūros pasiskirstymą.
Ant pav. 2 paveiksle parodytas temperatūros pasiskirstymas, išmatuotas CGM, gautas apšvitinus aukso nanodalelėmis padengtą stiklo pagrindą žiediniu lazerio spinduliu (1f pav.). Buvo pastebėtas plokščias temperatūros pasiskirstymas visame lazerio spindulio apimtame plote. Šioje zonoje buvo nustatyta 65°C, optimali augimo temperatūra. Už šios srities ribų temperatūros kreivė natūraliai nukrenta iki \(1/r\) (kur \(r\) yra radialinė koordinatė).
CGM matavimų temperatūros žemėlapis, gautas naudojant žiedinį lazerio spindulį, kad būtų apšvitintas aukso nanodalelių sluoksnis, kad būtų gautas plokščias temperatūros profilis apskritimo srityje. b Temperatūros žemėlapio izoterma (a). Lazerio spindulio kontūras pavaizduotas pilku taškiniu apskritimu. Eksperimentas buvo pakartotas du kartus (žr. Papildomos medžiagos, S4 pav.).
Bakterijų ląstelių gyvybingumas buvo stebimas keletą valandų naudojant LA-HTM. Ant pav. 3 parodytas laiko intervalas keturiems vaizdams, paimtiems iš 3 valandų 20 minučių filmo (filmas M3, papildoma informacija). Buvo pastebėta, kad bakterijos aktyviai dauginasi lazeriu apibrėžtoje apskritoje srityje, kur temperatūra buvo optimali, artėjant prie 65 ° C. Priešingai, ląstelių augimas žymiai sumažėjo, kai temperatūra nukrito žemiau 50 ° C 10 sekundžių.
G. stearothermophilus bakterijų, augančių po lazerio kaitinimo skirtingu laiku, optinio gylio vaizdai, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, out of 200 Išgauta iš vienos minutės filmo (M3 plėvelė, pateikta papildomoje informacijoje), uždėta ant atitinkamo temperatūros žemėlapio. Lazeris įsijungia laiku \(t=0\). Prie intensyvumo vaizdo pridėtos izotermos.
Norėdami toliau kiekybiškai įvertinti ląstelių augimą ir jo priklausomybę nuo temperatūros, išmatavome įvairių iš pradžių izoliuotų bakterijų kolonijų biomasės padidėjimą Movie M3 matymo lauke (4 pav.). Pirminės bakterijos, parinktos mini kolonijas formuojančio vieneto (mCFU) formavimosi pradžioje, parodytos S6 paveiksle. Sausos masės matavimai buvo atlikti naudojant CGM 48 kamerą, kuri buvo naudojama temperatūros pasiskirstymui nustatyti. LA-HTM stiprybė yra CGM gebėjimas matuoti sausos masės ir temperatūros matavimus. Kaip ir tikėtasi, aukšta temperatūra sukėlė greitesnį bakterijų augimą (4a pav.). Kaip parodyta pusiau logaritmėje diagramoje 4b pav., augimas visomis temperatūromis seka eksponentinį augimą, kur duomenys naudoja eksponentinę funkciją \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), kur \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}2\) – generavimo laikas (arba padvigubėjimo laikas), \( g =1/ \tau\) – augimo tempas (padalijimų skaičius per laiko vienetą ). Ant pav. 4c parodytas atitinkamas augimo greitis ir generavimo laikas kaip temperatūros funkcija. Greitai augantiems mCFU būdingas augimo prisotinimas po dviejų valandų, tikėtinas elgesys dėl didelio bakterijų tankio (panašus į stacionarią fazę klasikinėse skystosiose kultūrose). Bendra forma \(g\left(T\right)\) (4c pav.) atitinka numatomą G. stearothermophilus dviejų fazių kreivę, kurios optimalus augimo greitis yra apie 60–65°C. Suderinkite duomenis naudodami kardinalų modelį (S5 pav.)49 kur \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, o tai gerai sutampa su kitomis literatūroje nurodytomis reikšmėmis49. Nors nuo temperatūros priklausomi parametrai yra atkuriami, didžiausias \({G}_{0}\) augimo greitis gali skirtis priklausomai nuo eksperimento (žr. S7-S9 paveikslus ir filmą M4). Skirtingai nuo temperatūros pritaikymo parametrų, kurie turėtų būti universalūs, didžiausias augimo greitis priklauso nuo terpės savybių (maistinių medžiagų prieinamumo, deguonies koncentracijos) stebimoje mikroskalės geometrijoje.
a Mikrobų dauginimasis įvairiomis temperatūromis. mCFU: miniatiūriniai kolonijas formuojantys vienetai. Duomenys, gauti iš vienos bakterijos, augančios temperatūros gradiente, vaizdo įrašo (filmas M3). b Tas pats kaip (a), pusiau logaritminė skalė. c Augimo greitis\(\tau\) ir generavimo laikas\(g\), apskaičiuotas pagal tiesinę regresiją (b). Horizontalios klaidų juostos: temperatūros diapazonas, per kurį mCFU augimo metu išsiplėtė į regėjimo lauką. Vertikalios klaidų juostos: tiesinės regresijos standartinė paklaida.
Be normalaus augimo, kai kurios bakterijos kartais išplaukdavo į akis kaitinant lazeriu, o tai yra tikėtinas bakterijų, turinčių žiuželius, elgesys. Papildomoje informacijoje esantis filmas M5 rodo tokią plaukimo veiklą. Šiame eksperimente vienoda lazerio spinduliuotė buvo naudojama temperatūros gradientui sukurti, kaip parodyta 1d, e ir S3 paveiksluose. 5 paveiksle pavaizduotos dvi vaizdų sekos, parinktos iš M5 filmo, rodančios, kad viena bakterija juda kryptingai, o visos kitos bakterijos lieka nejudančios.
Du laiko intervalai (a) ir (b) rodo dviejų skirtingų bakterijų, pažymėtų punktyriniais apskritimais, plaukimą. Vaizdai buvo išgauti iš M5 filmo (pateikti kaip papildoma medžiaga).
G. stearothermophilus atveju aktyvus bakterijų judėjimas (5 pav.) prasidėjo praėjus kelioms sekundėms po lazerio spindulio įjungimo. Šis stebėjimas pabrėžia šio termofilinio mikroorganizmo laikiną reakciją į temperatūros padidėjimą, kaip jau pastebėjo Mora ir kt. 24 . Bakterijų judrumo ir net termotaksės temą galima toliau tyrinėti naudojant LA-HTM.
Mikrobų plaukimo nereikėtų painioti su kitais fizinio judėjimo tipais, būtent (i) Brauno judesiu, kuris atrodo kaip chaotiškas judėjimas be apibrėžtos krypties, (ii) konvekcija 50 ir termoforezė 43, kurią sudaro reguliarus judėjimo dreifas pagal temperatūrą. gradientas.
G. stearothermophilus yra žinomas dėl savo gebėjimo gaminti labai atsparias sporas (sporų susidarymą), kai yra veikiamas nepalankių aplinkos sąlygų, kaip gynybos priemonė. Kai aplinkos sąlygos vėl tampa palankios, sporos sudygsta, formuojasi gyvos ląstelės ir vėl pradeda augti. Nors šis sporuliacijos / dygimo procesas yra gerai žinomas, jis niekada nebuvo pastebėtas realiu laiku. Naudodami LA-HTM, čia pateikiame pirmąjį G. stearothermophilus daigumo įvykių stebėjimą.
Ant pav. 6a pavaizduoti optinio gylio (OT) vaizdai, gauti naudojant 13 sporų CGM rinkinį. Per visą rinkimo laiką (15 val. 6 min., \(t=0\) – lazerio kaitinimo pradžia) sudygo 4 iš 13 sporų, nuosekliais laiko momentais \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)" ir \(11\) h \(30\)". Nors 6 paveiksle parodytas tik vienas iš šių įvykių, papildomoje medžiagoje M6 filme galima stebėti 4 daigumo įvykius. Įdomu tai, kad daigumas atrodo atsitiktinis: ne visos sporos sudygsta ir nedygsta vienu metu, nepaisant tų pačių aplinkos sąlygų pokyčių.
Laikinas intervalas, susidedantis iš 8 OT vaizdų (naftos panardinimas, 60x, 1,25 NA objektyvas) ir (b) G. stearothermophilus agregatų biomasės raida. c (b) Nubrėžta pusiau logaritmėje skalėje, kad būtų paryškintas augimo greičio tiesiškumas (punktyrinė linija).
Ant pav. 6b, c parodyta ląstelių populiacijų biomasė regėjimo lauke kaip laiko funkcija per visą duomenų rinkimo laikotarpį. Greitas sausos masės skilimas, stebimas \ (t = 5\) h Fig. 6b, c, dėl kai kurių langelių išėjimo iš matymo lauko. Šių keturių įvykių augimo tempas yra \(0,77\pm 0,1\) h-1. Ši vertė yra didesnė už augimo greitį, susijusį su 3 paveikslais. 3 ir 4, kur ląstelės auga normaliai. Padidėjusio G. stearothermophilus augimo iš sporų priežastis neaiški, tačiau šie matavimai išryškina LA-HTM susidomėjimą ir dirba vienos ląstelės lygiu (arba vieno mCFU lygiu), siekiant sužinoti daugiau apie ląstelių gyvenimo dinamiką. .
Norėdami dar labiau parodyti LA-HTM universalumą ir jo veikimą aukštoje temperatūroje, ištyrėme Sulfolobus shibatae, hipertermofilinės acidofilinės archėjos, kurios optimali augimo temperatūra yra 80 °C51, augimą. Palyginti su G. stearothermophilus, šie archėjai taip pat turi labai skirtingą morfologiją, labiau primenantys 1 mikrono rutulius (kokius), o ne pailgas lazdeles (bacilas).
7a paveiksle pavaizduoti nuoseklūs S. shibatae mCFU optiniai gylio vaizdai, gauti naudojant CGM (žr. M7 vaidybinį filmą papildomose medžiagose). Šis mCFU auga maždaug 73 °C temperatūroje, žemesnėje už optimalią 80 °C temperatūrą, tačiau aktyvaus augimo temperatūrų diapazone. Stebėjome daugybę dalijimosi įvykių, dėl kurių mCFU po kelių valandų atrodė kaip archėjos mikrovynuogės. Iš šių OT vaizdų mCFU biomasė buvo išmatuota laikui bėgant ir pateikta 7b paveiksle. Įdomu tai, kad S. shibatae mCFU augimas buvo tiesinis, o ne eksponentinis augimas, pastebėtas naudojant G. stearothermophilus mCFU. Jau seniai diskutuojama52 apie ląstelių augimo tempų pobūdį: kai kuriuose tyrimuose teigiama, kad mikrobų augimo greitis yra proporcingas jų dydžiui (eksponentinis augimas), kiti rodo pastovų greitį (linijinis arba dvilinijinis augimas). Kaip paaiškino Tzur ir kt.53, norint atskirti eksponentinį ir (bi)tiesinį augimą, biomasės matavimo tikslumas turi būti <6 %, o tai nepasiekiama daugeliui QPM metodų, net naudojant interferometriją. Kaip paaiškino Tzur ir kt.53, norint atskirti eksponentinį ir (bi)tiesinį augimą, biomasės matavimo tikslumas turi būti <6 %, o tai nepasiekiama daugeliui QPM metodų, net naudojant interferometriją. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точрености <6% точрености ижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Kaip paaiškino Zur ir kt.53, norint atskirti eksponentinį ir (bi)tiesinį augimą, biomasės matavimuose reikia <6 % tikslumo, o tai nepasiekiama daugeliu QPM metodų, net naudojant interferometriją.Kaip paaiškino Zur ir kt. 53, norint atskirti eksponentinį ir (bi) linijinį augimą, biomasės matavimo tikslumas yra mažesnis nei 6%, o tai neįmanoma pasiekti daugeliui QPM metodų, net kai naudojama interferometrija. CGM pasiekia šį tikslumą mažesniu nei pg tikslumu atliekant biomasės matavimus36,48.
Laikinas intervalas, susidedantis iš 6 OT vaizdų (naftos panardinimas, 60x, NA objektyvas 1,25) ir (b) mikro-CFU biomasės raida, išmatuota naudojant CGM. Daugiau informacijos rasite filme M7.
Tobulai tiesinis S. shibatae augimas buvo netikėtas ir apie jį dar nepranešta. Tačiau numatomas eksponentinis augimas, bent jau todėl, kad laikui bėgant turi įvykti daugybinis 2, 4, 8, 16 … ląstelių dalijimasis. Iškėlėme hipotezę, kad linijinis augimas gali atsirasti dėl ląstelių slopinimo dėl tankaus ląstelių pakavimo, kaip ir ląstelių augimas sulėtėja ir galiausiai pasiekia ramybės būseną, kai ląstelių tankis yra per didelis.
Baigdami paeiliui aptariame šiuos penkis įdomius dalykus: šildymo tūrio sumažinimą, šiluminės inercijos sumažinimą, susidomėjimą aukso nanodalelėmis, susidomėjimą kiekybine fazės mikroskopija ir galimą temperatūros diapazoną, kuriame galima naudoti LA-HTM.
Palyginti su varžiniu šildymu, HTM kūrimui naudojamas šildymas lazeriu turi keletą pranašumų, kuriuos iliustruojame šiame tyrime. Visų pirma, skystose terpėse mikroskopo regėjimo lauke šildymo tūris išlaikomas kelių (10 μm) 3 tūrių ribose. Tokiu būdu aktyvūs yra tik stebimi mikrobai, o kitos bakterijos yra ramybės būsenoje ir gali būti naudojamos tolesniam mėginio tyrimui – nereikia kaskart keisti mėginio, kai reikia tikrinti naują temperatūrą. Be to, mikroskopinis šildymas leidžia tiesiogiai ištirti didelį temperatūrų diapazoną: 4c paveikslas buvo gautas iš 3 valandų filmo (Movie M3), kuriam paprastai reikia paruošti ir ištirti kelis mėginius – po vieną kiekvienam tiriamam mėginiui. y yra temperatūra, nurodanti eksperimento dienų skaičių. Sumažinus šildomą tūrį, visi aplinkiniai mikroskopo optiniai komponentai, ypač objektyvo lęšis, išlaikomi kambario temperatūroje, o tai iki šiol buvo pagrindinė bendruomenės problema. LA-HTM galima naudoti su bet kokiu objektyvu, įskaitant panardinamuosius lęšius, ir išliks kambario temperatūroje net esant ekstremalioms regėjimo lauko temperatūroms. Pagrindinis lazerinio šildymo metodo, apie kurį pranešame šiame tyrime, apribojimas yra tas, kad ląstelės, kurios neprilimpa arba plūduriuoja, gali būti toli nuo regėjimo lauko ir jas sunku ištirti. Norint pasiekti didesnį temperatūros kilimą, viršijantį kelis šimtus mikronų, būtų galima išspręsti mažo didinimo lęšius. Šį atsargumą lydi erdvinės skiriamosios gebos sumažėjimas, tačiau jei tikslas yra ištirti mikroorganizmų judėjimą, didelės erdvinės skiriamosios gebos nereikia.
Sistemos šildymo (ir vėsinimo) laiko skalė \({{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) priklauso nuo jos dydžio , pagal įstatymą \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), kur \ (L\ ) yra būdingas šilumos šaltinio dydis (mūsų tyrimo lazerio spindulio skersmuo yra \(L\ apie 100\) μm), \(D\) yra aplinkos šiluminis difuziškumas (vidutinis mūsų korpusas, stiklas ir vanduo Difuzijos greitis\(D\ apie 2\ kartus {10}^{-7}\) m2/s). Galima tikėtis temperatūros pokyčių.
Mūsų siūlomas metodas tinka bet kokiam šviesą sugeriančiam substratui (pavyzdžiui, komerciniams pavyzdžiams su ITO danga). Tačiau aukso nanodalelės gali užtikrinti didelę infraraudonųjų spindulių absorbciją ir mažą absorbciją matomame diapazone, kurių pastarosios charakteristikos yra įdomios efektyviam optiniam stebėjimui matomame diapazone, ypač naudojant fluorescenciją. Be to, auksas yra biologiškai suderinamas, chemiškai inertiškas, optinį tankį galima reguliuoti nuo 530 nm iki artimųjų infraraudonųjų spindulių, o mėginio paruošimas yra paprastas ir ekonomiškas29.
Skersinės grotelės bangos fronto mikroskopija (CGM) leidžia ne tik nustatyti temperatūrą mikroskalėje, bet ir stebėti biomasę, todėl ji ypač naudinga (jei nebūtina) kartu su LA-HTM. Per pastarąjį dešimtmetį buvo sukurti kiti temperatūros mikroskopijos metodai, ypač biologinio vaizdo gavimo srityje, ir daugeliui jų reikia naudoti temperatūrai jautrius fluorescencinius zondus54, 55. Tačiau šie metodai buvo kritikuojami, o kai kuriose ataskaitose buvo išmatuoti nerealūs temperatūros pokyčiai ląstelėse, galbūt dėl to, kad fluorescencija priklauso nuo daugelio kitų veiksnių, išskyrus temperatūrą. Be to, dauguma fluorescencinių zondų yra nestabilūs aukštoje temperatūroje. Todėl QPM ir ypač CGM yra idealus temperatūros mikroskopijos metodas tiriant gyvenimą aukštoje temperatūroje naudojant optinę mikroskopiją.
S. shibatae, kurie optimaliai gyvena 80°C temperatūroje, tyrimai rodo, kad LA-HTM galima taikyti tiriant hipertermofilus, o ne tik paprastus termofilus. Iš esmės nėra jokių apribojimų temperatūrų diapazonui, kurį galima pasiekti naudojant LA-HTM, ir net aukštesnę nei 100 °C temperatūrą galima pasiekti esant atmosferos slėgiui be virimo, kaip įrodė mūsų 38 grupė hidroterminės chemijos taikymuose atmosferos temperatūroje. slėgis A. Lazeris naudojamas aukso nanodalelėms kaitinti 40 tokiu pat būdu. Taigi LA-HTM gali būti naudojamas stebėti precedento neturinčius hipertermofilus naudojant standartinę didelės skiriamosios gebos optinę mikroskopiją standartinėmis sąlygomis (ty esant aplinkos įtampai).
Visi eksperimentai buvo atlikti naudojant naminį mikroskopą, įskaitant Köhler apšvietimą (su LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), mėginių laikiklį su rankiniu xy judesiu, objektyvus (Olympus, 60x, 0,7 NA, orą, LUCPlanFLN60X arba 60x, 1,25 NA , UPLFLN60XOI), CGM kamera (QLSI kryžminė grotelė, 39 µm žingsnis, 0,87 mm nuo Andor Zyla fotoaparato jutiklio), kuri užtikrina intensyvumo ir bangos fronto vaizdą, ir sCMOS kamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16 bitų režimas, iš Hamamatsu), kad įrašytų duomenys pateikti 5 paveiksle (bakterijų plaukimas). Dichroinis pluošto skirstytuvas yra 749 nm BrightLine briauna (Semrock, FF749-SDi01). Kameros priekyje esantis filtras yra 694 trumpojo pralaidumo filtras (FF02-694/SP-25, Semrock). Titano safyro lazeris (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumpuojamas cunamio lazerio ertmė, Spectra-Physics 2-5 pav., toliau pakeistas Millenia lazeriu, Spectraphysics 10 W, pumpuojamas Mira lazerio ertmė, koherentas, skirtas 2 pav. -5). 6 ir 7) nustatyti bangos ilgiui \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, kuris atitinka aukso nanodalelių plazmoninio rezonanso spektrą. Erdviniai šviesos moduliatoriai (1920 × 1152 pikseliai) buvo įsigyti iš Meadowlark Optics. Hologramos buvo apskaičiuotos naudojant Gerchberg-Saxton algoritmą, kaip aprašyta 39 nuorodoje.
Kryžminės gardelės bangos fronto mikroskopija (CGM) yra optinės mikroskopijos metodas, pagrįstas dvimatės difrakcijos gardelės (taip pat žinomos kaip kryžminės gardelės) derinimas vieno milimetro atstumu nuo įprasto fotoaparato jutiklio. Labiausiai paplitęs CGM pavyzdys, kurį naudojome šiame tyrime, vadinamas keturių bangų ilgio skersinio poslinkio interferometru (QLSI), kuriame kryžminė grotelė susideda iš intensyvumo / fazės šaškių lentos modelio, kurį pristatė ir patentavo Primot ir kt. 2000 m.34. Vertikalios ir horizontalios gardelės linijos sukuria tinklelį primenančius šešėlius ant jutiklio, kurių iškraipymas gali būti skaičiais apdorotas realiuoju laiku, kad būtų gautas krintančios šviesos optinis bangos fronto iškraipymas (arba lygiavertis fazės profilis). Naudojant mikroskopą, CGM kamera gali parodyti vaizduojamo objekto optinio kelio skirtumą, dar vadinamą optiniu gyliu (OT), kurio jautrumas yra maždaug nanometrų36. Atliekant bet kokį CGM matavimą, siekiant pašalinti bet kokius optinių komponentų ar pluoštų defektus, turi būti paimtas pirminis etaloninis OT vaizdas ir atimtas iš bet kokių paskesnių vaizdų.
Temperatūros mikroskopija buvo atlikta naudojant CGM kamerą, kaip aprašyta nuorodoje. 32. Trumpai tariant, kaitinant skystį keičiasi jo lūžio rodiklis, sukuriamas šiluminio lęšio efektas, kuris iškreipia krintantį spindulį. Šis bangos fronto iškraipymas matuojamas CGM ir apdorojamas naudojant dekonvoliucijos algoritmą, kad būtų gautas trimatis temperatūros pasiskirstymas skystoje terpėje. Jei aukso nanodalelės yra tolygiai paskirstytos visame mėginyje, temperatūros žemėlapis gali būti atliktas vietose, kuriose nėra bakterijų, kad būtų gauti geresni vaizdai, o tai kartais darome. Etaloninis CGM vaizdas buvo gautas be šildymo (išjungus lazerį) ir vėliau užfiksuotas toje pačioje vaizdo vietoje, kai lazeris įjungtas.
Sausos masės matavimas pasiekiamas naudojant tą pačią CGM kamerą, kuri naudojama temperatūros vaizdavimui. CGM etaloniniai vaizdai buvo gauti greitai perkeliant mėginį į x ir y ekspozicijos metu, kad būtų galima nustatyti bet kokį nehomogeniškumą OT dėl bakterijų buvimo. Iš OT bakterijų vaizdų jų biomasė buvo gauta naudojant vaizdų rinkinį srityse, parinktose naudojant Matlab naminį segmentavimo algoritmą (žr. poskyrį „Skaičių kodas“), laikantis procedūros, aprašytos nuorodoje. 48. Trumpai tariant, mes naudojame santykį \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), kur \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) yra optinio gylio vaizdas, \(m\) yra sauso svorio ir \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) yra konstanta. Mes pasirinkome \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, kuri yra tipiška gyvų ląstelių konstanta.
25 mm skersmens ir 150 µm storio dangtelis, padengtas aukso nanodalelėmis, buvo įdėtas į AttofluorTM kamerą (Thermofisher) aukso nanodalelėmis į viršų. Geobacillus stearothermophilus buvo iš anksto kultivuojamas per naktį LB terpėje (200 aps./min., 60 ° C) prieš kiekvieną eksperimento dieną. 5 µl G. stearothermophilus suspensijos, kurios optinis tankis (OD) nuo 0,3 iki 0,5, buvo užlašinamas ant dengiamojo stiklelio su aukso nanodalelėmis. Tada ant lašo buvo nuleistas apvalus 18 mm skersmens dengiamasis stiklelis su 5 mm skersmens skyle centre, o skylės centre pakartotinai užtepta 5 μl tokio paties optinio tankio bakterijų suspensijos. Dangtelių šuliniai buvo paruošti pagal procedūrą, aprašytą nuorodoje. 45 (daugiau informacijos žr. Papildomoje informacijoje). Tada į dengiamąjį stiklelį įpilkite 1 ml LB terpės, kad skystas sluoksnis neišdžiūtų. Paskutinis dengiantis stiklas uždedamas ant uždaro Attofluor™ kameros dangčio, kad inkubacijos metu terpė neišgaruotų. Daiginimo eksperimentams naudojome sporas, kurios po įprastinių eksperimentų kartais uždengdavo viršutinį dengiamąjį stiklelį. Panašus metodas buvo naudojamas sulfolobus shibatae gauti. Tris dienas (200 aps./min., 75 °C) buvo atliktas išankstinis Thiobacillus serrata auginimas 182 terpėje (DSMZ).
Aukso nanodalelių mėginiai buvo paruošti micelinio bloko kopolimero litografija. Šis procesas išsamiai aprašytas skyriuje. 60. Trumpai tariant, aukso jonus inkapsuliuojančios micelės buvo susintetintos sumaišius kopolimerą su HAuCl4 toluene. Tada nuvalyti dangteliai buvo panardinti į tirpalą ir apdoroti UV spinduliuote, dalyvaujant reduktoriui, kad būtų gautos aukso sėklos. Galiausiai aukso sėklos buvo auginamos kontaktuojant dangtelį su vandeniniu KAuCl4 ir etanolamino tirpalu 16 minučių, todėl artimoje infraraudonojoje spinduliuotėje buvo beveik periodiškas ir labai vienodas ne sferinių aukso nanodalelių išdėstymas.
Norėdami konvertuoti interferogramas į OT vaizdus, naudojome naminį algoritmą, kaip išsamiai aprašyta nuorodoje. 33 ir yra prieinamas kaip „Matlab“ paketas šioje viešoje saugykloje: https://github.com/baffou/CGMprocess. Paketas gali apskaičiuoti intensyvumą ir OT vaizdus pagal įrašytas interferogramas (įskaitant etaloninius vaizdus) ir fotoaparato matricos atstumus.
Norėdami apskaičiuoti SLM taikomą fazės modelį, kad gautume tam tikrą temperatūros profilį, naudojome anksčiau sukurtą naminį algoritmą 39, 42, kurį galite rasti šioje viešoje saugykloje: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Įvestis yra norimos temperatūros laukas, kurį galima nustatyti skaitmeniniu būdu arba naudojant vienspalvį bmp vaizdą.
Norėdami suskirstyti ląsteles ir išmatuoti jų sausą svorį, naudojome „Matlab“ algoritmą, paskelbtą šioje viešoje saugykloje: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Ant kiekvieno vaizdo vartotojas turi spustelėti dominančią bakteriją arba mCFU, sureguliuoti lazdelės jautrumą ir patvirtinti pasirinkimą.
Daugiau informacijos apie studijų planavimą rasite gamtos tyrimų ataskaitos santraukoje, susietoje su šiuo straipsniu.
Duomenis, patvirtinančius šio tyrimo rezultatus, atitinkami autoriai pateikia pagrįstu prašymu.
Šiame tyrime naudojamas šaltinio kodas yra išsamiai aprašytas skyriuje Metodai, o derinimo versijas galima atsisiųsti iš https://github.com/baffou/ šiose saugyklose: SLM_temperatureShaping, CGMprocess ir CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Įžvalga apie termofilus ir jų plataus spektro taikymą. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Įžvalga apie termofilus ir jų plataus spektro taikymą.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. ir Sharma, AK Termofilų apžvalga ir platus jų pritaikymas. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. ir Sharma AK Gilus termofilų supratimas ir platus pritaikymo spektras.3 Biotechnology 6, 81 (2016).
Paskelbimo laikas: 2022-09-26